Interacción entre bacteriófagos T4 y E. coli en el intestino murino: un modelo prototípico para estudiar la dinámica huésped-bacteriófago in vivo

Resumen

Los bacteriófagos (fagos), virus que infectan a las bacterias, son un componente integral del microbioma intestinal. Aunque estos habitantes simbióticos impulsan la aptitud bacteriana y la dinámica de la población, se sabe poco sobre cómo afectan a la homeostasis intestinal y a la enfermedad. Este protocolo estudia fagos T4 aislados dentro de un modelo de ratón, adaptables a otros pares fago-bacteriano.

Resumen

Los bacteriófagos (fagos) son virus que infectan bacterias con especificidad a nivel de especie y cepa y son las entidades biológicas más abundantes en todos los ecosistemas conocidos. Dentro de las comunidades bacterianas, como las que se encuentran en la microbiota intestinal, los fagos están implicados en la regulación de la dinámica de las poblaciones de microbiota y en el impulso de la evolución bacteriana. En la última década ha habido un renovado interés en la investigación de fagos, en parte debido a las capacidades de eliminación específicas del huésped de los fagos líticos, que ofrecen una herramienta prometedora para contrarrestar la creciente amenaza de las bacterias resistentes a los antimicrobianos. Además, estudios recientes que demuestran que los fagos se adhieren al moco intestinal sugieren que pueden tener un papel protector en la prevención de la invasión bacteriana en el epitelio subyacente. Es importante destacar que, al igual que los microbiomas bacterianos, los fageomas alterados se han asociado con peores resultados en enfermedades como la enfermedad inflamatoria intestinal. Estudios anteriores han demostrado que los fagos pueden modular el microbioma de animales y humanos a través de trasplantes de filtrado fecal, lo que beneficia la salud del huésped. Con esta reciente ola de investigación surge la necesidad de establecer y estandarizar protocolos para estudiar los fagos en el contexto del microbioma intestinal. Este protocolo proporciona un conjunto de procedimientos para estudiar los fagos T4 aislados y su huésped bacteriano, Escherichia coli, en el contexto del tracto gastrointestinal murino. Los métodos descritos aquí describen cómo partir de un lisado de fagos, administrarlo a ratones y evaluar los efectos sobre el huésped bacteriano y los niveles de fagos. Este protocolo puede modificarse y aplicarse a otros pares fago-bacteria y proporciona un punto de partida para estudiar la dinámica huésped-fago in vivo.

Introducción

Los bacteriófagos, o fagos, son virus que infectan y matan bacterias con especificidad a nivel de especie y cepa^. Los fagos desempeñan un papel importante dentro de comunidades bacterianas complejas, como la microbiota intestinal, donde se han implicado en la regulación de la dinámica de la población y en la mejora de la aptitud bacteriana². A lo largo de la última década, ha habido un renovado interés en la investigación de fagos debido al aumento de patógenos resistentes a los antimicrobianos³ y el potencial de la terapia con fagos como estrategia de tratamiento alternativa. En los últimos años,....

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité de Cuidado de Animales de la UBC y los protocolos aprobados por el Comité de Bioseguridad (A23-0113, B19-0038). Los ratones se alojaron en la Universidad de Columbia Británica en condiciones libres de patógenos en el Centro de Modelado de Enfermedades. Los ratones C57BL/6 se criaron dentro de la instalación en un aislador de película flexible estéril, provisto de dieta estéril para ratones, agua, ropa de cama y material de anidación. Los ratones se mantuvieron en un ciclo día/noche de 12 h. Los ratones experimentales, tanto machos como hembras, fueron emparejados por edad de....

Discusión

El estudio de los fagos en el microbioma presenta un desafío significativo en comparación con sus contrapartes bacterianas. Específicamente, los fagos no contienen un marcador filogenético conservado común a todos los fagos similar a las subunidades ribosómicas 16S y 18S que permitan la facilidad en la secuenciación e identificación de especies procariotas y eucariotas, respectivamente⁴². Sin embargo, con los avances en los enfoques de secuenciación de próxima generación, incluido el au.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-octanol (99%)	Thermofisher	CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	Millipore Sigma	SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade)	Fisher BioReagents	BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100	Millipore Sigma	UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST	BD Medical	365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)	Techiplast	1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module	BioRad	1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder)	Fisher BioReagents	BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk	Andwin Scientific	16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS)	Fisher	C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm)	Crosman Corporation	0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50)	Thermo Scientific	69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X)	Thermo Scientific	K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O	Sigma Aldrich	E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™	Fisher Bioreagents	BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher Bioreagents	BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns	QuantaBio	95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED	Techiplast	UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate	Fisher BioReagents	BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker	Thermo Scientific	8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox	Fisher BioReagents	BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml	Fisher	14-666-315
Parafilm sealing film	Bemis	PM-996
Phage stocks	Carolina Biological Supply	n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT	LabDiet	5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit	Thermo Scientific	A39552S
RNase A (17,500 U)	Qiagen	19101
RNase-free DNase Set	Qiagen	79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder)	Fisher Chemical	BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS)	Fisher Chemical	S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50)	Fisher scentific	n/a
Sterile flexible film isolator	Class Biologically Clean	n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA)	IDT	n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA)	IDT	n/a
TissueLyser II	Qiagen	85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure	Thermo Scientific	AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free)	Fisher BioReagents	BP2484100