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  • Resumen
  • Resumen
  • Introducción
  • Protocolo
  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este manuscrito describe un protocolo de video detallado para el cultivo de células epiteliales del cristalino primario (LEC), con el objetivo de mejorar la reproducibilidad y ayudar a la investigación en cataratas y opacificación de la cápsula posterior (PCO). Ofrece instrucciones paso a paso sobre la disección de lentes, el aislamiento de LEC y la validación, lo que sirve como una guía valiosa, especialmente para los recién llegados al campo.

Resumen

Las células epiteliales del cristalino (LEC, por sus siglas en inglés) desempeñan múltiples funciones importantes en el mantenimiento de la homeostasis y la función normal del cristalino. Los LEC determinan el crecimiento, el desarrollo, el tamaño y la transparencia de las lentes. Por el contrario, las LEC disfuncionales pueden conducir a la formación de cataratas y a la opacificación de la cápsula posterior (OCP). En consecuencia, el establecimiento de un sistema robusto de cultivo primario de LEC es importante para los investigadores que se dedican al desarrollo de lentes, la bioquímica, la terapéutica de cataratas y la prevención del SOP. Sin embargo, el cultivo de LEC primarios ha presentado desafíos durante mucho tiempo debido a su disponibilidad limitada, su lenta tasa de proliferación y su naturaleza delicada.

Este estudio aborda estos obstáculos mediante la presentación de un protocolo integral para el cultivo primario de LEC. El protocolo abarca pasos esenciales como la formulación de un medio de cultivo optimizado, el aislamiento preciso de las cápsulas de cristalino, las técnicas de tripsinización, los procedimientos de subcultivo, los protocolos de cosecha y las directrices para el almacenamiento y el envío. A lo largo del proceso de cultivo, se monitorizó la morfología celular mediante microscopía de contraste de fase.

Para confirmar la autenticidad de las LEC cultivadas, se realizaron ensayos de inmunofluorescencia para detectar la presencia y distribución subcelular de proteínas críticas del cristalino, a saber, αA- y γ-cristalinas. Este protocolo detallado equipa a los investigadores con un recurso valioso para cultivar y caracterizar las LEC primarias, lo que permite avances en nuestra comprensión de la biología del cristalino y el desarrollo de estrategias terapéuticas para los trastornos relacionados con el cristalino.

Introducción

El cristalino del ojo desempeña un papel crucial en la visión al enfocar la luz entrante en la retina. Consiste en una estructura transparente y avascular compuesta por células especializadas, entre las cuales las células epiteliales del cristalino (LEC) son actores clave. Las LEC se localizan en la superficie anterior del cristalino y son responsables de mantener su transparencia, regular el equilibrio hídrico y participar en el crecimiento y desarrollo del cristalino 1,2. Las LEC son un tipo único de células ubicadas en la parte anterior del cristalino, que desempeñan un papel fundamental en el mantenimiento de la claridad y la función del cristalino mediante la producción continua de fibras del cristalino a lo largo de la vida.

Las cataratas se caracterizan por la opacidad progresiva del cristalino, lo que resulta en la distorsión y dispersión de la luz, lo que lleva a una visión comprometida 3,4. Los mecanismos precisos que subyacen a la formación de cataratas son complejos y multifactoriales, e involucran diversos procesos celulares y moleculares como la radiación UV, el daño oxidativo y la glicación 5,6. Se ha encontrado que las LEC contribuyen significativamente al desarrollo de cataratas, lo que las convierte en un foco vital de investigación 1,2,7,8,9.

Además, uno de los problemas más apremiantes en oftalmología hoy en día es la incidencia relativamente alta de opacificación de la cápsula posterior (OCP), también conocida como catarata secundaria. El SOP sigue siendo la complicación más frecuente después de la cirugía de cataratas, afectando hasta al 20-40% de los pacientes adultos y al 100% de los niños dentro de los 5 años posteriores a la cirugía10. El SOP es causado principalmente por los LEC residuales que permanecen en la bolsa capsular después de la extracción de cataratas. Estas células experimentan una transformación fisiopatológica multifacética que involucra no solo la transición epitelial a mesenquimal (EMT), sino también la diferenciación de las LEC a las fibras del cristalino, lo que da como resultado una población celular que es una mezcla de LEC, fibras y miofibroblastos 11,12,13. Las células transformadas proliferan y migran a través de la cápsula posterior del cristalino, lo que provoca discapacidad visual. Comprender el comportamiento y los mecanismos de control de los LEC en los modelos de cultivo puede proporcionar información valiosa sobre la prevención y el tratamiento del PCO. Por lo tanto, este protocolo de cultivo de LEC presenta una herramienta vital para los investigadores oftalmológicos que buscan estudiar, comprender y, en última instancia, combatir esta complicación postoperatoria prevalente.

Para desentrañar las complejidades de la biología de la LEC y su papel en la formación de cataratas y PCO, es esencial establecer sistemas de cultivo celular primario in vitro robustos y reproducibles. El cultivo primario de LEC proporciona a los investigadores un entorno controlado para estudiar las funciones, la señalización y las características moleculares de las LEC. Además, permite la investigación de los procesos celulares y los efectos de diferentes condiciones experimentales, proporcionando información valiosa sobre la fisiología y la patología del cristalino.

Investigaciones previas han enriquecido nuestra comprensión de las técnicas de cultivo LEC 14,15,16,17,18,19,20. Aunque estos estudios han empleado diversas metodologías y han arrojado hallazgos significativos sobre el comportamiento y las características de los LEC, en la literatura actual no existe un protocolo de grabación de video completo y accesible para el cultivo de LEC. Esta limitación puede dificultar la capacidad de los investigadores novatos para reproducir con precisión las técnicas y puede dar lugar a inconsistencias y variaciones en los resultados experimentales. Al proporcionar un protocolo de grabación de video, este trabajo de investigación tiene como objetivo cerrar esta brecha y proporcionar un recurso estandarizado que pueda mejorar la reproducibilidad y facilitar la transferencia de conocimiento en el campo de la cultura LEC.

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Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices de la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión. La aprobación del procedimiento fue otorgada por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad del Norte de Texas (número de protocolo: IACUC-2022-0008). En estos estudios se utilizaron ratones jóvenes C57BL/6J, por lo general menores de 2 semanas de edad.

1. Preparación del medio de cultivo y disección del cristalino

  1. Prepare el medio de cultivo añadiendo 50 mL de suero fetal bovino (FBS) y 0,1 mL de 50 mg/mL de gentamicina a 450 mL de DMEM.
  2. Sacrificar humanamente a ratones C57BL/6J menores de 2 semanas.
    NOTA: Practicamos la eutanasia utilizando el método de inhalación de CO2 . Un caudal óptimo para los sistemas de eutanasia con CO2 debe desplazar entre el 30% y el 70% del volumen de la cámara o jaula por minuto.
  3. Retire suavemente los párpados con unas tijeras quirúrgicas y aplique una presión delicada con pinzas curvas en lados opuestos de la cuenca del ojo, haciendo que el ojo sobresalga hacia afuera. Haga una incisión cuidadosa en la córnea con el bisturí de cataratas y extraiga con cuidado la lente con unas pinzas curvas, asegurándose de que no dañe la lente ni su cápsula.
    NOTA: Tenga cuidado al realizar estos pasos para mantener la integridad de la cápsula de la lente. Debido a la naturaleza delicada de la lente, es importante utilizar herramientas de disección con puntas curvas y romas para minimizar el riesgo de dañar la lente.
  4. Utilice pinzas curvas con puntas romas para transferir las lentes a una placa de cultivo de tejidos de plástico de 60 mm llena de 5 ml de solución salina tamponada con fosfato (DPBS) precalentada y estéril de Dulbecco que contiene 10 μg/ml de gentamicina.
  5. Enjuague suavemente las lentes con una solución DPBS que contenga 10 μg/ml de gentamicina para eliminar cualquier posible residuo o contaminante, preparar las lentes para su posterior procesamiento y mantener un entorno de cultivo estéril.
  6. Para obtener un número adecuado de LEC, agrupe cuatro lentes para una placa de cultivo de 24 pocillos y seis lentes para una placa de cultivo de 6 pocillos.

2. Aislamiento de LECs

  1. Después de completar el proceso de enjuague, coloque la lente sobre un trozo de papel de filtro, dejando que se seque.
  2. Una vez que la lente esté adecuadamente seca, transfiérala con cuidado a la cubierta de una placa de Petri en preparación para la extracción de la cápsula de la lente.
  3. Gire la lente hacia arriba, asegurándose de que el segmento anterior esté hacia arriba. Mientras usa las pinzas para sostener la cápsula anterior, emplee las pinzas de capsulorrexis en la mano dominante para crear un pequeño desgarro en la cápsula. Tire suavemente de las dos herramientas en direcciones opuestas para extraer la cápsula y colóquela en DPBS hasta que se completen todas las disecciones de la lente.
    NOTA: Para evitar discrepancias, los investigadores deben diseccionar rápidamente cada cápsula epitelial del cristalino y almacenarlas temporalmente en DPBS. Solo después de completar todas las disecciones las cápsulas se transfieren colectivamente a tripsina mantenidas a 37 °C, lo que garantiza una exposición sincronizada y uniforme.
  4. Transfiera con cuidado la cápsula de la lente a una placa de 6 pocillos. Agregue 1 ml de solución de tripsina al 0,05% a cada pocillo para iniciar el proceso de digestión enzimática.
  5. Agite suavemente la solución de tripsina para asegurar una permeabilidad uniforme. Colocar la placa en una incubadora de cultivos celulares y dejar digerir la cápsula durante 8-10 min a 37 °C.
    NOTA: Este paso facilita la descomposición del tejido de la cápsula del cristalino y la posterior liberación de células epiteliales individuales.
  6. Después de la incubación, pique cuidadosamente la cápsula del cristalino digerida con unas tijeras de disección para descomponer los grumos de tejido restantes y promover la separación celular.
    NOTA: Se enfatiza la minuciosidad en la picadura de los tejidos para garantizar una liberación celular eficiente de las cápsulas del cristalino digeridas.
  7. Añadir 0,5 ml del medio de cultivo que contenga un 10% de FBS para apagar la tripsina. Transfiera las muestras de tejido a un tubo de centrifugación y centrifugue a 1.000 × g durante 5 min.
  8. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar el gránulo de la celda. Use 1 ml de medio de cultivo para resuspender las células y sembrarlas en una placa de 24 pocillos.
  9. Cambie el medio de cultivo cada 2-3 días.

3. Subcultura de las LECs

  1. Una vez que las células logren la confluencia, retire el medio de la placa de cultivo. Proceda a lavar las células 2 veces con 1 mL de DPBS.
  2. Añadir 200 μL de solución de tripsina-EDTA y colocar las células en la incubadora durante 5 min.
  3. Después de la incubación, retire las células de la incubadora e inspecciónelas bajo un microscopio para confirmar que se han desprendido de la placa de cultivo y han comenzado a flotar.
  4. Agregue 1 ml de medio de cultivo y pipetee suavemente las células 3-5 veces para separar todas las células.
  5. Transfiera las células a los tubos de la centrífuga y centrifugue a 1.000 × g durante 5 min.
  6. Retire con cuidado el sobrenadante y vuelva a suspender las células en el medio de crecimiento completo.
  7. Si es necesario, cuente el número de células con un hemocitómetro.
  8. Subdivida la suspensión celular en una proporción de 1:2 o 1:3 para fines de subcultivo.
  9. Cuando el cultivo vuelva a ser confluente, repita los procedimientos antes mencionados.
    NOTA: Los LEC florecen en condiciones de cultivo de alta densidad. Evite diluir excesivamente las células, ya que esto puede dificultar su crecimiento.

4. Almacenamiento y envío

NOTA: El número de celda ideal para el almacenamiento es ~ 1 × 106.

  1. Lave bien las células 3 veces con 1 ml de DPBS. Después del lavado, agregue 1 ml de solución de tripsina-EDTA y coloque las células en la incubadora durante 5 minutos.
  2. Añadir 2 mL de medio de cultivo completo y transferir la suspensión celular al tubo de centrífuga y centrifugar a 1.000 × g durante 5 min.
  3. Desechar el sobrenadante y resuspender las células en un medio de congelación compuesto por 90% de FBS y 10% de DMSO, con el objetivo de obtener una densidad celular de 1 × 106 células/mL. Transfiera la suspensión celular a la criovial.
  4. Mueva inmediatamente las celdas a un ambiente de -20 °C durante 1 h, seguido de -80 °C durante la noche, antes del almacenamiento permanente en nitrógeno líquido.
    NOTA: Si no se dispone de nitrógeno líquido, las celdas pueden almacenarse a -80 °C después de una hora inicial a -20 °C.
  5. Si se requiere un envío, envíe las células en el criovial en un paquete con hielo seco para su entrega al día siguiente.
  6. Una vez recibidas las células, asegure una rápida recuperación y coloque las células en el subcultivo. Si el cultivo inmediato no es factible, transfiera las células a nitrógeno líquido para un almacenamiento prolongado.
    NOTA: Si las celdas van a ser enviadas, asegúrese de que las muestras estén profundamente enterradas en el hielo seco para evitar posibles daños por fluctuaciones de temperatura.

5. Validación de LECs

  1. Coloque los LEC en placas de cultivo de 35 mm con cubreobjetos y cultívelos durante aproximadamente 48 h.
  2. Lavar las celdas 2 veces con PBS y fijar las celdas con metanol frío durante 10 min a -20 °C.
  3. Lavar las celdas fijas durante 3 x 5 min con PBS e incubar las celdas fijas con tampón de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente para evitar la unión inespecífica.
  4. Después del bloqueo, incubar las células durante la noche a 4 °C con los anticuerpos primarios (αA-cristalina, γ-cristalina y anticuerpos PROX1) diluidos individualmente en una proporción de 1:50 en tampón diluyente.
  5. Lavar las células durante 3 x 5 min con PBS e incubar las células con el anticuerpo secundario diluido 1:100 en tampón diluyente durante 1 h.
  6. Lavar las células durante 3 x 5 min con PBS y teñir las células con 5 μg/mL Hoechst 33342 en PBS durante 10 min a temperatura ambiente para visualizar los núcleos.
  7. Lave las células durante 2 x 5 minutos con PBS para eliminar el exceso de solución de tinción y capture imágenes fluorescentes de las células utilizando un microscopio de fluorescencia utilizando el canal DAPI para los núcleos y el canal FITC para αA-, γ-cristalinas y PROX1.

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Resultados

Como se muestra en la Figura 2, siguiendo este protocolo, los LEC primarios de ratones C57BL/6J se adhirieron a las placas en un período de 4 h. En particular, había restos visibles de otros tejidos, como secciones de la cápsula posterior y células de fibra del cristalino. Sin embargo, estos elementos no deseados no se adherían a la placa y, por lo tanto, podían eliminarse cambiando el medio de cultivo. Posteriormente, entre el tercer y quinto día, los LECs iniciaron su fase de prolif...

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Discusión

El protocolo presentado en este documento proporciona una guía completa, paso a paso, para el aislamiento, la cultura y la subcultura exitosos de los LEC primarios, con documentación en video que lo acompaña. La guía visual detallada junto con las instrucciones escritas mejora la claridad y accesibilidad del protocolo, promoviendo su uso y reproducibilidad entre los investigadores en el campo. El objetivo final es contribuir a la expansión del cuerpo de conocimientos en torno al papel de las LEC en la formación de ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo contó con el apoyo de NEI R21EY033941 (a Hongli Wu); Departamento de Defensa W81XWH2010896 (a Hongli Wu); R15GM123463-02 (a Kayla Green y Hongli Wu)

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher#25300054For LECs dissociation
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody Jackson ImmunoResearch#715-545-150For cell validation
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-605-003For cell validation
Antibody dilution bufferLicor#927-60001For cell validation
Beaver safety knifeBeaver-Visitec International#3782235For lens dissection
Blocking bufferLicor#927-60001For cell validation
Capsulorhexis forcepsTitan Medical InstrumentsTMF-124For lens capsule isolation
DMEMSigma AldrichD6429For LECs culture medium
DMSOSigma Aldrich#D2650For making freezing medium 
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher#J67802For lens dissection
Dumont tweezersRoboz Surgical InstrumentRS-4976For lens capsule isolation
EpiCGS-a (optional)ScienCell4182For LECs culture medium
FBSSigma AldrichF2442For LECs culture medium
Gentamicin (50 mg/mL)Sigma-AldrichG1397For LECs culture medium
Hoechst 33342 solutionThermo Fisher#62249For cell validation
Micro-dissecting scissorsRoboz Surgical Instrument RS-5983For lens dissection
Micro-dissecting tweezersRoboz Surgical Instrument RS5137 For lens dissection
PROX1 antibodyThermo Fisher11067-2-APFor cell validation
Vannas micro-dissecting spring scissorsRoboz Surgical InstrumentRS-5608For lens capsule isolation
αA-crystallin antibodySanta Cruzsc-28306For cell validation 
γ-crystallin antibodySanta Cruzsc-365256For cell validation

Referencias

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