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Resumen

En este trabajo se presenta un protocolo para inducir hipertensión tipo H y se evalúan los efectos antihipertensivos de la decocción de Huotan Jiedu Tongluo (HTJDTLD) administrada por vía intragástrica. En ratas con hipertensión tipo H, HTJDTLD tuvo efectos antihipertensivos efectivos, posiblemente asociados con la inhibición de la activación de la vía de apoptosis inducida por el estrés del retículo endoplásmico (RE).

Resumen

La hipertensión de tipo H, que es una forma específica de hipertensión caracterizada por niveles elevados de homocisteína plasmática (Hcy), se ha convertido en un importante desafío de salud pública en todo el mundo. Este estudio investigó los efectos hipotensores y los mecanismos subyacentes de la decocción de Huotan Jiedu Tongluo (HTJDTLD), una fórmula de medicina tradicional china altamente efectiva comúnmente utilizada para tratar la estenosis vascular. La metionina se utilizó para inducir hipertensión tipo H en ratas, y la HTJDTLD se administró por vía intragástrica. A continuación, se midieron las presiones sistólicas y diastólicas de la arteria caudal de las ratas mediante manometría caudal no invasiva en ratas. La evaluación histológica de la aorta se realizó mediante tinción con hematoxilina-eosina (HE). Se utilizó el ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA) para medir los niveles de Hcy, y la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR) y el western blot para determinar los niveles de ARNm y proteínas de la proteína reguladora de glucosa 78 (GRP78), el factor 2 asociado al receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAF2), las quinasas c-Jun N-terminal (JNK) y la caspasa-3. Los resultados mostraron que HTJDTLD disminuyó significativamente la presión arterial, alivió las lesiones histopatológicas y disminuyó los niveles de Hcy después del tratamiento con metionina. Además, HTJDTLD inhibió significativamente la expresión génica y proteica de GRP78, JNK, TRAF2 y caspasa 3, que están implicadas principalmente en la vía de apoptosis inducida por el estrés del retículo endoplásmico (RE). En general, los resultados indicaron que HTJDTLD tuvo efectos antihipertensivos efectivos en ratas con hipertensión tipo H y revelaron los mecanismos antihipertensivos asociados con la inhibición de la activación de la vía de apoptosis inducida por el estrés del RE.

Introducción

La hipertensión, un importante factor de riesgo de ataque cardíaco, accidente cerebrovascular e insuficiencia renal, se ha convertido en un importante desafío de salud pública que afecta a 1.000 millones de personas en todo el mundo. La homocisteína (Hcy), un aminoácido que contiene el grupo tiol, es un intermediario metabólico vital del metabolismo de la metionina. La hipertensión con niveles plasmáticos elevados de Hcy se define como hipertensión tipo H, que podría ser un factor de riesgo significativo para la aparición y recurrencia de enfermedades cardiocerebrovasculares como el accidente cerebrovascular 2,3. Estudios recientes han reportado que la co-residencia de la hipertensión tipo H podría agravar los efectos secundarios de las enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares4. Cabe destacar que el 75% de los pacientes con hipertensión tipo H en China tienen hipertensión primaria, lo que afecta seriamente la calidad de vida5. En la actualidad, el tratamiento de la hipertensión tipo H incluye principalmente la medicina occidental. Sin embargo, puede causar ciertos efectos adversos y un cumplimiento deficiente y ya no puede satisfacer las necesidades para el manejo integral de la hipertensión tipo H.

La medicina tradicional china (MTC) es un recurso único con una historia de más de 2.000 años en China. Debido a la necesidad insatisfecha de control de la hipertensión en la medicina occidental, los médicos han comenzado a considerar el papel potencial de la medicina tradicional china en la prevención y el tratamiento de la hipertensión tipoH 6. La decocción de Huotan Jiedu Tongluo (HTJDTLD) es una fórmula de medicina tradicional china formulada por el profesor Yue Deng, basada en su amplia experiencia clínica7. A lo largo de más de 20 años de aplicación clínica, HTJDTLD ha demostrado una notable eficacia en el tratamiento de enfermedades cardiovasculares y cerebrovasculares1. Sin embargo, no se ha informado si la HTJDTLD tiene efectos terapéuticos en la hipertensión tipo H. Por lo tanto, nos propusimos explorar los efectos antihipertensivos y los mecanismos específicos de HTJDTLD en ratas con hipertensión tipo H e identificar posibles fármacos terapéuticos para el tratamiento de la hipertensión tipo H.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Medicina China de Changchun. Los materiales se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Animales y trato

  1. Divida aleatoriamente un total de 50 ratas adultas espontáneamente hipertensas (SHR) (machos, 50 días de edad) en cinco grupos, incluidos los grupos control (CON), metionina (MET), MET + HTJDTLD + maleato de enalapril (EM), MET + EM y MET + HTJDTLD.
    NOTA: Las ratas experimentales fueron alojadas en un ambiente controlado diseñado para garantizar su comodidad y bienestar. La instalación contaba con habitaciones con temperatura controlada a 22 °C constantes, con una humedad relativa del 40-60%. Las jaulas de alojamiento estaban hechas de policarbonato transparente, proporcionando un amplio espacio para que cada rata se moviera libremente. El programa de iluminación siguió un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas, simulando las condiciones de luz natural del día. A las ratas se les proporcionó comida y agua adecuadas.
  2. Proporcione a las ratas la siguiente dieta durante 28 días.
    1. Administre a las ratas del grupo MET una dieta de metionina al 3% durante 28 días para inducir hipertensión tipo H.
    2. Administrar a las ratas del grupo MET + HTJDTLD + EM por vía intragástrica HTJDTLD (1,633 g/mL) y EM (0,2 mg/mL) a la dosis de 1 mL/kg cuando las ratas además de la dieta de metionina al 3%.
    3. Administrar a las ratas de los grupos MET + EM y MET + HTJDTLD HTJDTLD o EM por sonda nasogástrica, respectivamente, además de la dieta de metionina al 3%.
      NOTA: El HTJDTLD consta de Fructus Trichosanthis (20 g), Radix et Rhizoma Salviae miltiorrhizae (15 g), Lonicerae japonicae flos (30 g), Radix et Rhizoma Nardostachyos (15 g), Radix Angelicae sinensis (15 g), Radix et Rhizoma Glycyrrhizae (10 g), Hirudo (5 g), Radix et Rhizoma Rhodiolae crenulatae (15 g) y Radix Scrophulariae (15 g), y fue decocido como se informó anteriormente7. La EM disuelta en agua purificada (0,2 mg/mL) sirvió como control positivo.

2. Medición de la presión arterial

NOTA: Las mediciones de la presión arterial se realizan utilizando un esfigmomanómetro no invasivo (Tabla de Materiales).

  1. Después del tratamiento durante 28 días, ayune las ratas de cada grupo durante 12 h y mida la presión arterial.
  2. Elige un dispositivo de sujeción que coincida con el tamaño de la rata. El dispositivo de restricción utilizado en este estudio comprende una malla de restricción cilíndrica, una cubierta de lona, un tubo térmico y una almohadilla de espuma estabilizadora. Coloque la rata en la malla de restricción, coloque la malla de restricción en el tubo térmico y luego coloque el tubo térmico en la cubierta de lona.
  3. Coloque el cable de señal en una posición adecuada debajo de la cubierta. Coloque la cola de la rata en el espacio provisto en la cubierta y asegúrela en la almohadilla estabilizadora del encofrado. Se prefiere un ambiente desocupado, tranquilo y cálido para las mediciones. Mueva las ratas al sitio de medición con 20-30 minutos de anticipación para que las ratas puedan adaptarse al entorno de medición.
    NOTA: Los pasos 2.2-2.3 se pueden realizar varias veces para estabilizar las ratas. Después de varias sesiones de entrenamiento, las ratas se acostumbrarán y podrán estabilizarse muy rápidamente, lo cual es conveniente para la medición posterior de la presión arterial.
  4. Conecte la conexión de la manguera de aire del sensor presurizado, la conexión de señal y el tubo de retención. Coloque el sensor de presurización en la punta de la cola.
  5. Mide la presión arterial. Aparece una onda de pulso después de que la cola de rata se inserta en el sensor. Presione Start/Stop para iniciar/detener la medición.
    NOTA: El dispositivo determinará automáticamente si la cola de la rata está insertada en el sensor. Cuando la cola de la rata no está insertada, el sensor de presurización no comenzará a presurizar y no realizará la medición.
  6. Cuando se complete la prueba de presión arterial, el menú Resultados aparecerá automáticamente. Compruebe el valor medio de la medición, la desviación estándar (DE), el error estándar (SE) y el coeficiente de variación (CV) en el menú Resultados .
    NOTA: Se midió la presión arterial de cada rata tres veces, con un intervalo de más de 2 min, y se calculó el valor medio.
  7. Después de medir la presión arterial, eutanasiar a la rata mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 2% en exceso (100 mg/kg). Luego, con tijeras quirúrgicas y pinzas dentadas, diseccione la rata capa por capa desde el perineo hasta el cuello. Dé la vuelta al contenido torácico y abdominal, navegue hasta la bifurcación de la aorta abdominal entre los dos riñones y recoja la aorta hasta una sección del arco aórtico.

3. Tinción de hematoxilina-eosina (HE)

  1. Fijar el tejido vascular aórtico en paraformaldehído al 4% durante al menos 24 h.
  2. Toma las muestras vasculares, deshidratándolas en alcohol de gradiente, hazlas transparentes en xileno e insótalas en parafina.
  3. Después de incrustar, haga rodajas continuas con un grosor de 3-5 mm. Seque las lonchas a 60-70 °C y guárdelas a temperatura ambiente (RT).
  4. Desparafinar las secciones sumergiéndolas en xileno I durante 30 minutos, xileno II durante 30 minutos, 100% de alcohol I durante 10 minutos, 100% de alcohol II durante 10 minutos, 95% de alcohol I durante 5 minutos, 95% de alcohol II durante 5 minutos, 80% de alcohol durante 5 minutos y luego enjuagar con agua destilada.
  5. Tiñe las secciones con hematoxilina Harris durante 5 minutos y enjuaga con agua del grifo durante 5 minutos. Diferenciar en alcohol de ácido clorhídrico al 1% durante 10 s y enjuagar abundantemente con agua del grifo durante 15 min. Lave la sección en agua amoniacal durante 5 s y enjuague bien con agua del grifo durante 15 minutos.
  6. Realice la observación microscópica, tiña con eosina durante 10 minutos y enjuague bien con agua del grifo durante 15 minutos.
  7. Deshidrata las secciones sumergiéndolas en alcohol etílico al 80% durante 10 s, alcohol al 95% I durante 5 min, alcohol al 95% II durante 5 min, alcohol al 100% I durante 10 min, alcohol al 100% II durante 10 min, xileno I durante 10 min y xileno II durante 10 min.
  8. Selle las secciones con goma neutra.
  9. Observar los cambios histológicos en los tejidos de la aorta bajo un microscopio óptico (objetivo de 100x, aumento de 1000x).

4. Tinción tricrómica de Masson

  1. Realice una rutina de desparafinado similar a la tinción HE.
  2. Tinción con hematoxilina: Sumerja los portaobjetos en la solución de hematoxilina durante 10 minutos, luego enjuague con agua del grifo inmediatamente.
  3. Sumerja los portaobjetos en una solución de ácido clorhídrico al 1% durante unos segundos, luego enjuague con agua del grifo inmediatamente después.
  4. Sumerja los portaobjetos en la tinción magenta ácida de Lichtenstein durante 5 minutos y luego enjuague con agua.
  5. Sumerja los portaobjetos en ácido fosfomolíbdico al 1% durante 5 min.
  6. Sumerja los portaobjetos en una tinción con azul de anilina al 2% durante 5 minutos y en una solución de lavado por inmersión con ácido acético glacial al 1% durante 1 minuto. Luego, lave los portaobjetos rápidamente en alcohol al 95% 3 veces.
  7. Realice la deshidratación de rutina, la transparencia y el sellado neutro de las encías similar a la tinción HE.

5. Medición de Hcy por ELISA

  1. Anestesiar a las ratas mediante inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 2% (45 mg/kg) y confirmar la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en el dedo del pie. Sostén la rata y córtale los bigotes para evitar el contacto al extraer sangre. Retire los globos oculares de la rata con pinzas curvas y recoja la sangre en los tubos de microcentrífuga estériles preparados. Y luego, sacrificar a la rata con una inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico al 2% en exceso (100 mg/kg).
  2. Deje que la sangre se coagule naturalmente durante 10-20 min a RT, y luego centrifugue (626-1409 x g) la sangre durante unos 20 min a 2-8 °C.
  3. Recoja cuidadosamente el sobrenadante y guárdelo en el refrigerador a -80 °C.
  4. Diluya el patrón en el tubo de ensayo de acuerdo con las instrucciones del kit.
  5. Configure pozos en blanco (no se agregan muestras ni reactivos enzimáticos a los pozos de control en blanco; el resto de los pasos son los mismos), pozos estándar y pozos de muestra para analizar. Agregue 50 μL de patrón en la placa, 40 μL de solución de dilución de muestra en los pocillos de muestra y luego 10 μL de suero (la dilución final de la muestra es 5 veces).
    NOTA: Agregue la muestra al fondo de los pocillos del plato; Trate de no tocar las paredes de los pozos y agite suavemente para mezclar.
  6. Sellar la placa con film sellador e incubar a 37 °C durante 30 min.
  7. Diluya la solución de lavado 30 veces concentrada 30 veces con agua destilada y prepárela para su uso.
  8. Retire la película de sellado con cuidado, deseche el líquido y agítelo para eliminar todo el líquido. Llene cada pocillo con solución de lavado, déjelo durante 30 s y deséchelo. Repita esto 5 veces y séquelo con golpecitos.
  9. Agregue 50 μL de reactivo enzimático a cada pocillo, excepto a los pocillos en blanco.
  10. Utilice una película de sellado para sellar la placa y luego incube a 37 °C durante 30 min.
  11. Repita el paso 5.8.
  12. Agregue 50 μL de revelador de color A a cada pocillo, luego agregue 50 μL de revelador de color B y agite suavemente para mezclar bien. Incubar a 37 °C durante 10 min con poca luz.
  13. Agregue 50 μL de la solución de parada a cada pocillo para terminar la reacción (el color azul se volverá amarillo).
  14. Ponga a cero la reacción con pozos en blanco y mida la absorbancia (valor OD) de cada pocillo secuencialmente a 450 nm.
    NOTA: La medición debe realizarse dentro de los 15 minutos posteriores a la adición de la solución de tope.

6. Extracción de ARN y RT-PCR cuantitativa

  1. Extracto de ARN total.
    1. Corte el tejido aórtico fresco rápidamente al tamaño adecuado (30-50 mg / pieza) y muélalo bien en nitrógeno líquido. Agregue 1 ml de reactivo Trizol, mezcle bien e incube en hielo durante 10 minutos para lisar el tejido.
    2. Centrifugar a 2250 x g durante 10 min a 4 °C. Transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga sin pellet.
    3. Añadir 200 μL de cloroformo, agitar enérgicamente durante 15 s e incubar a RT durante 5 min.
    4. Centrifugar a 2250 x g durante 15 min a 4 °C. La mezcla se dividirá en tres capas: la fase orgánica inferior de fenol-cloroformo, la fase intermedia y la fase acuosa superior.
    5. Transfiera con cuidado la fase acuosa superior a un nuevo tubo de microcentrífuga (aproximadamente el 60% del volumen de Trizol). No aspire la fase intermedia; Se puede dejar una pequeña cantidad de líquido superior.
    6. Añadir un volumen igual de isopropanol, mezclar suavemente invirtiendo unas 10 veces, y dejar actuar durante 10 min a temperatura larga.
    7. Centrifugar a 2250 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y lave el precipitado de ARN dos veces con 1 mL de etanol al 75%.
    8. Centrifugar a 2250 x g durante 5 min a 4 °C, desechar el sobrenadante y secar al aire a RT durante 5-10 min.
    9. Disuelva el ARN en 15-50 μL de agua de dietilpirocarbonato (DEPC) y compruebe la concentración de ARN.
  2. Realizar transcripción inversa y RT-qPCR (Tabla 1)
    1. Detectar la expresión génica relacionada con el estrés del retículo endoplásmico (ERS) y la apoptosis mediante qRT-PCR. Utilice el ARN total extraído en el paso 6.1 y transcriba inversamente a ADNc utilizando el kit de síntesis de ADNc de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Determine la expresión génica utilizando un sistema de detección de PCR en tiempo real con una mezcla maestra de PCR verde SYBR en un volumen de reacción de 20 μL.
    3. Analice cuantitativamente los datos por el método 2−ΔΔCTy expréselos como una diferencia de n veces en relación con la expresión de β-actina. Los cebadores se muestran en la Tabla 2.

7. Western blot (WB)

  1. Extraer la proteína total del tejido.
    1. Coloque una pequeña cantidad de bloque de tejido en la parte esférica del homogeneizador de 1-2 ml y corte el bloque de tejido tanto como sea posible con unas tijeras limpias.
    2. Añadir 400 μL (w:v=1:10) del tampón de lisis RIPA y homogeneizar. Luego, colócalo sobre hielo. Pasados unos minutos, vuelve a moler y coloca sobre hielo. Repita el proceso de molienda varias veces.
    3. Después de 30 minutos de lisis, utilice una pipeta para transferir el lisado a un tubo de centrífuga de 1,5 ml y coloque el tubo en una centrífuga preenfriada a 4 °C. Centrifugar a 2250 x g durante 10 min y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de centrífuga de 1,5 mL.
  2. Cuantificar la proteína.
    1. Diluya los estándares de proteína de acuerdo con las instrucciones del kit. Obtenga gradientes de patrones de la siguiente manera: 0, 25, 125, 250, 500, 1000, 1500 y 2000 ng/μL.
    2. Tome 2,5 μL de la muestra de proteína y dilúyala a 25 μL (10 veces) utilizando el diluyente de muestra.
    3. Tome una placa de 96 pocillos y agregue 20 μL de muestra de proteína estándar (de acuerdo con el gradiente de concentración) y proteína objetivo a los pocillos, respectivamente, dos pocillos para cada muestra de proteína objetivo.
    4. Prepare la solución de revelado (lista para usar) mezclando el líquido A y el líquido B en una proporción de 50:1, y agregue 200 μL de solución de revelado a cada pocillo.
    5. Coloque la placa de 96 pocillos con las muestras añadidas en una incubadora a 37 °C durante 30 min.
    6. Detecta la absorbancia a 562 nm.
    7. Calcular la concentración de proteína que se va a medir.
      1. Tome la concentración estándar de proteínas como la coordenada vertical y la absorbancia a 562 nm como la coordenada horizontal para dibujar la curva estándar.
      2. Calcule la concentración de la proteína objetivo en función de la fórmula obtenida de la curva estándar y la absorbancia medida de la proteína objetivo.
    8. Añadir 180 μL de tampón de carga a 20 μL de muestra de proteína en un tubo de microcentrífuga. Coloque el tubo de centrífuga en un baño de metal y desnaturalice a 100 °C durante 10 min. Utilice la proteína desnaturalizada WB o guárdela a -20 °C.
  3. Realizar inmunotransferencia.
    1. Configurar gel de electroforesis de proteínas.
      1. Limpie y seque la placa de vidrio de fundición en gel (1 mm o 1,5 mm) y fíjela en el dispositivo de fundición en gel.
      2. Prepare gel de separación al 10% de acuerdo con la Tabla 3. Agregue el gel separador configurado entre las placas de vidrio. Agregue la solución de gel lentamente para evitar la producción de burbujas de aire. Luego, agregue una cantidad adecuada de etanol anhidro para aplanar la superficie líquida del separador. Déjalo actuar a temperatura activa durante 20-30 minutos hasta que el gel se solidifique.
        NOTA: Cuanto mayor sea el peso molecular, menor será la concentración de pegamento, de acuerdo con la necesidad de formular otras concentraciones de pegamento separador.
      3. Preparar gel concentrado al 5% de acuerdo a la Tabla 3. Después de la solidificación del gel de separación, vierta la capa superior de etanol anhidro, llene el gel concentrado e inserte lentamente el peine de gel que coincida con la placa de vidrio (tenga cuidado de no tener burbujas de aire). Déjalo actuar durante 20-30 minutos para que el gel concentrado se solidifique.
    2. Realizar electroforesis.
      1. Pesa 60,5 g de Tris, 375 g de glicina y 20 g de dodecil sulfato de sodio (SDS). Agregue agua a 2 L, caliente a 60 °C y revuelva para disolver y formar una solución de electroforesis 10x. Que la solución esté en RT; Dilúyelo a 1x cuando lo uses.
      2. Retire la placa de vidrio que contiene pegamento del dispositivo de fundición en gel, tire hacia abajo del peine de pegamento en el flujo de agua a una velocidad uniforme y, al mismo tiempo, drene las burbujas de aire en el orificio de muestreo.
      3. Fije la placa de vidrio en el tanque de electroforesis y agregue la solución de electroforesis 1x configurada. Asegúrese de que el tanque interior esté lleno y que el tanque exterior sea la mitad del tanque interior.
      4. Añada la misma masa de muestra de proteína y 5 μL de marcador (utilizado para indicar el tamaño de la proteína) en el pocillo de adición de la muestra.
      5. Haga funcionar el gel a 60 V durante 20 minutos, luego a 100 V durante 90 minutos hasta que el tampón de carga llegue al fondo.
    3. Realizar la transferencia de membrana.
      1. Pesar 60 g de Tris y 288 g de glicina, y añadir agua a 2 L. Agitar y disolver bien la solución para hacer 10x solución de transferencia de membrana, y reservar en RT. Diluir en una proporción de 1:2:7 (10x solución transmembrana: metanol: agua) para hacer 1x solución de trabajo.
        NOTA: La solución transmembrana debe prepararse con anticipación y enfriarse a 4 °C en el refrigerador.
      2. Remojar el PVDF en metanol durante un período de tiempo adecuado (0,5-1 min) para activar los grupos cargados positivamente en la membrana y facilitar su unión con proteínas cargadas negativamente.
      3. Tome el clip de transferencia de membrana y fíjelo después de colocar los componentes en orden (superficie negra-esponja-papel de filtro-gel de electroforesis-PVDF membrana-papel de filtro-esponja-superficie blanca en secuencia).
        NOTA: Tenga cuidado de evitar las burbujas de aire; Cuando haya burbujas de aire, use el rodillo para expulsar las burbujas de aire.
      4. Coloque la férula en el tanque de transferencia de membrana, preste atención a seguir la colocación correcta de los electrodos, coloque dos bolsas de hielo en el tanque y llénelo con 1x líquido de transferencia de membrana. Finalmente, coloque todo el tanque transmembrana en hielo.
      5. Ajuste las condiciones de transferencia de la membrana a 100 V durante 1 h.
        NOTA: El tiempo de transferencia de la membrana se puede ajustar de acuerdo con el tamaño de la proteína; Cuanto menor sea el peso molecular de la proteína, menor será el tiempo de transferencia de la membrana.
    4. Realizar el bloqueo.
      1. En el caso de las proteínas fosforiladas, utilice un 5% de BSA (disolvente TBST) como solución de bloqueo. En el caso de las proteínas no fosforiladas, utilice leche desnatada al 5% (disolvente TBST) para el bloqueo.
      2. Vierta la solución de bloqueo en un plato de tamaño adecuado. Coloque la membrana de PVDF en el plato y asegúrese de que la membrana de PVDF esté sumergida en la solución de bloqueo. Cerrar la placa e incubar a RT durante 1 h.
      3. Retire la membrana. De acuerdo con la pantalla del marcador y el tamaño de cada proteína objetivo, corte la membrana en el tamaño apropiado y etiquétela con números de serie.
    5. Incubar el anticuerpo
      1. Retire la solución de bloqueo y absorba el líquido residual con papel de filtro. Coloque el PVDF cortado correspondiente en las diluciones de anticuerpos correspondientes (incluidos CPR78 [1:1000], TRAF2 [1:1000], p-JNK [1:1000], caspasa [1:1000] y GAPDH [1:1000]) y colóquelo en el agitador giratorio a 4 °C durante la noche.
      2. Agregue 1x TBST y enjuague a RT tres veces (10 min cada una).
      3. Incubar la membrana de PVDF en las diluciones de anticuerpos secundarios según las instrucciones del fabricante e incubar en RT durante 1 h.
      4. Enjuague la membrana agregando 1x TBST a RT tres veces (10 min cada una).
    6. Desarrollar la membrana PVDF.
      1. Mezcle volúmenes iguales de líquido A y líquido B en el kit de solución luminiscente, agite bien y prepárese para usar.
      2. Coloque la membrana de PVDF sobre la película adhesiva para extenderla y agregue rápida y uniformemente el agente luminiscente preparado sobre la membrana de manera rápida y uniforme. Incubar durante 3 min a RT, evitando la luz.
      3. Detecte las bandas de proteínas utilizando reactivos de detección de Western blot de quimioluminiscencia mejorada (ECL).

8. Análisis de datos

  1. Exprese todos los datos como la media ± S.D. Realice análisis estadísticos por ANOVA de un factor utilizando el software SPSS 20.0. Considere las diferencias estadísticamente significativas cuando p < 0,05.

Resultados

Como se muestra en la Tabla 4 y la Tabla 5, la presión arterial sistólica (PAS) y la presión arterial diastólica (PAD) fueron significativamente mayores en el grupo MET que en el grupo CON de 1 a 4 semanas. Después del tratamiento con HTJDTLD, la PAS y la PAD de las ratas fueron significativamente más bajas que las del grupo MET. En particular, la utilización combinada de HTJDTLD y EM tuvo un efecto antihipertensivo más fuerte que el tratamiento con HTJDTLD solo.

Discusión

La hipertensión es uno de los trastornos cardiovasculares más comunes que afecta a un tercio de la población adulta y aumenta el riesgo de accidente cerebrovascular, enfermedad coronaria e insuficiencia cardíaca y renal8. La hipertensión tipo H es un tipo especial de hipertensión que se refiere a la co-ocurrencia de hipertensión primaria y aumento de los niveles de homocisteína y ha atraído una amplia atención a lo largo de los años9. En los últimos años, el us...

Divulgaciones

Declaramos que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de la provincia de Jilin (no. YDZJ202301ZYTS189).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCRYeasen,China11149EScDNA synthesis kit 
Anti-beta-actin antibodyBioss, Chinabs-0061R
Anti-caspase-3 antibodyBioss, Chinabs-0081R
Anti-GPR78 antibodyAbcam, USAab108513
Anti-JNK antibodyAbcam, USAab76572
Anti-p-JNK antibodyBioss, Chinabsm-52462R
Anti-rabbit IgG antibodyBioss, Chinabs-0295G-HRP
Anti-TRAF2 antibodyBioss, Chinabs-22372R
Bio-Rad CFX96 Touch system Bio-RadCFX96real-time PCR detection system 
ECL Western Blot SubstratesMerck, MA, USAWBULP-10ML
Enalapril maleate folic acid tabletsYangzijiang Pharmaceutical Company, China20040991
FastStart SYBR Green MasterSigmaFSSGMMRO
Fructus TrichosanthisThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
HirudoThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
intelligent noninvasive sphygmomanometer Beijing Softron Biotechnology companyBP-2010A
Lonicerae Japonicae FlosThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
MethionineSigma, USAM9500
Radix Angelicae SinensisThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma GlycyrrhizaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma NardostachyosThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma Rhodiolae CrenulataeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix et Rhizoma Salviae MiltiorrhizaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Radix ScrophulariaeThe First Affiliated Hospital of Changchun University of Traditional Chinese Medicine, ChinaNo catalog number
Rat Hcy ELISA KitsShanghai Meimian Industrial Company, ChinaMM-0293R2
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Referencias

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