Imágenes en tiempo real de la dinámica del calcio acrosómico y la exocitosis en espermatozoides de ratón vivos

Resumen

El modelo de ratón AcroSensE y los métodos de obtención de imágenes de células vivas descritos aquí proporcionan un nuevo enfoque para estudiar la dinámica del calcio en el compartimento subcelular del acrosoma, el espermatozoide, y cómo regulan los pasos intermedios que conducen a la fusión de la membrana y la exocitosis acrosómica.

Resumen

La exocitosis acrosómica (EA), en la que la única vesícula exocitótica del espermatozoide se fusiona con la membrana plasmática, es un proceso complejo dependiente del calcio esencial para la fertilización. Sin embargo, nuestra comprensión de cómo la señalización del calcio regula la EA aún es incompleta. En particular, la interacción entre la dinámica del calcio intraacrosómica y los pasos intermedios que conducen a la EA no está bien definida. Aquí, describimos un método que proporciona información espacial y temporal sobre la dinámica del calcio acrosómico y su relación con la fusión de la membrana y la posterior exocitosis de la vesícula acrosómica. El método utiliza un nuevo ratón transgénico que expresa un sensor de exocitosis dirigido a acrosomas (AcroSensE). El sensor combina un indicador de calcio codificado genéticamente (GCaMP) fusionado con mCherry. Esta proteína de fusión fue diseñada específicamente para permitir la observación simultánea de la dinámica del calcio acrosómico y los eventos de fusión de membrana. La monitorización en tiempo real de la dinámica del calcio acrosómico y de los EA en espermatozoides vivos de AcroSensE se logra mediante una combinación de imágenes de alta velocidad de fotogramas y un sistema de administración de estimulantes que puede dirigirse a un solo espermatozoide. Este protocolo también proporciona varios ejemplos de métodos básicos para cuantificar y analizar los datos sin procesar. Debido a que el modelo AcroSensE está codificado genéticamente, su importancia científica puede aumentarse mediante el uso de herramientas genéticas fácilmente disponibles, como el cruzamiento con otros modelos genéticos de ratón o métodos basados en la edición de genes (CRISPR). Con esta estrategia, se pueden resolver los roles de las vías de señalización adicionales en la capacitación y fertilización de los espermatozoides. En resumen, el método descrito aquí proporciona una herramienta conveniente y efectiva para estudiar la dinámica del calcio en un compartimento subcelular específico, el acrosoma, y cómo esa dinámica regula los pasos intermedios que conducen a la fusión de la membrana y la exocitosis acrosómica.

Introducción

Los espermatozoides adquieren la capacidad de fertilizar durante un proceso llamado capacitación¹. Un punto final de este proceso es que los espermatozoides adquieren la capacidad de sufrir EA. Más de dos décadas de datos respaldan la presencia de un modelo complejo y de varios pasos de EA en espermatozoides de mamíferos (resumido en ^2,3). Sin embargo, el estudio de la EA en espermatozoides vivos es un reto, y los métodos disponibles actualmente para monitorizar este proceso con una resolución adecuada son engorrosos y requieren múltiples pasos de preparación⁴, se limitan a la detección del paso final de la EA (por ejemplo, utilizando PNA⁵), se limitan a las mediciones de los cambios en el calcio citosólico (en contraste con la dinámica del calcio acrosómico), o se limitan a mediciones de la dinámica del calcio citosólico o de la EA⁶.

Para superar algunas de las limitaciones clave de los estudios de EA en tiempo real en condiciones fisiológicas y para permitir la investigación de la interacción entre la dinámica del calcio y la EA, se generó un modelo de ratón único. En este modelo de ratón, una proteína de fusión compuesta por el sensor Ca²⁺ codificado genéticamente (GCaMP3) y mCherry se expresa y se dirige al acrosoma, utilizando un promotor de acrosina y el péptido de señalización². El sensor dual GCaMP3-mCherry permite realizar mediciones simultáneas en tiempo real de las concentraciones de calcio y el estado del contenido acrosómico en espermatozoides vivos en condiciones fisiológicas utilizando microscopía y un sistema de administración de estimulantes de una sola célula (Figura 1). Como componente de la matriz acrosómica, la fusión de membranas y la EA darían lugar a la pérdida de la fluorescencia mCherry fotoestable e insensible al pH de los espermatozoides, ya que esta proteína se difunde fuera de la vesícula acrosómica. En este sentido, la capacidad del modelo para reflejar el momento y la aparición de EA es similar a los beneficios de la línea de ratón GFP dirigida al acrosoma^{, 7,8,9}.

La variante GCaMP3 utilizada en esta línea de ratones transgénicos tiene un KD aproximado de 400 μM y un rango dinámico para Ca²⁺ de 10-4-10-3 M¹⁰, que es adecuado para esta vesícula. Demostramos que esta combinación de características de GCaMP3 podría revelar la formación de poros de fusión entre la membrana plasmática y la membrana acrosómica externa (OAM)². La detección de poros de fusión es el resultado de que el tamaño de los poros es demasiado pequeño para permitir que la proteína AcroSensE se disperse fuera del acrossoma (a través de la pérdida del contenido de acrosoma) mientras proporciona un "canal" de membrana que permite la entrada de iones Ca²⁺ en la luz del acrosoma, lo que lleva a un aumento en la intensidad de fluorescencia del GCaMP3.

La proteína fluorescente mCherry, brillante, monomérica y no sensible al calcio, favorece la visualización del acrosoma mientras la señal GCaMP3 es débil (por ejemplo, antes de la unión de Ca²⁺ , Figura 2) y, lo que es más importante, también permite la identificación de espermatozoides intactos con acrosomas adecuados para la obtención de imágenes.

El siguiente protocolo describe la utilización del modelo de ratón único AcroSensE y los métodos de microscopía utilizados experimentalmente para estudiar la dinámica del calcio de los EA y los espermatozoides con alta resolución espacial y temporal.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron bajo las pautas y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Cornell (#2002-0095). Para el presente estudio se utilizaron ratones AcroSensE² de 8-10 semanas de edad. Las solicitudes de información sobre la disponibilidad de los ratones AcroSensE pueden enviarse al autor correspondiente.

1. Recolección y lavado de esperma

1. Recolectar espermatozoides del epidídimo de la cola (se proporcionan más detalles sobre este procedimiento en¹¹) de ratones AcroSensE. Espere 15 minutos para nadar en una placa de cultivo de tejidos de 3,5 cm que contenga 0,5 ml de medio de blanqueamiento modificado (MW) a 37 °C. El plato debe cubrirse para reducir la evaporación del MW y debe inclinarse de modo que el medio tenga suficiente profundidad para cubrir los epidídimos de la cauda.
   NOTA: El medio de Whitten modificado (MW) incluye 22 mM de HEPES, 1,2 mM de MgCl₂, 100 mM de NaCl, 4,7 mM de KCl, 1 mM de ácido pirúvico, 4,8 mM de sal de hemi-Ca²⁺ de ácido láctico, pH de 7,35. La glucosa (5,5 mM), NaHCO₃ (10 mM) y 2-hidroxipropil-ciclodextrina (CD; 3 mM) se suplementan (ver Tabla de Materiales) según sea necesario para la inducción de la capacitación, y las concentraciones pueden modificarse para experimentos específicos. Además, se podrían utilizar aceptores de esteroles alternativos en lugar de CD (por ejemplo, albúmina sérica bovina o lipoproteínas de alta densidad).
2. Con unas pinzas finas, retire cualquier tejido epididimario de la placa de recolección de natación. Transfiera el medio que contiene los espermatozoides a un tubo cónico de 15 ml y centrifugue la suspensión a 100 x g durante 1 minuto en un rotor de cubo oscilante a temperatura ambiente. Con una pipeta de plástico, retire el sobrenadante MW que contiene los espermatozoides de cualquier residuo de tejido grueso que se haya granulado en este paso.
3. Llevar el sobrenadante MW que contiene los espermatozoides a un volumen total de 3 ml añadiendo MW a 37 °C. Centrifugar a 400 x g durante 8 min (a temperatura ambiente) en un tubo de fondo redondo. Retire lentamente el sobrenadante de MW de los espermatozoides sueltos.
4. Si es viable, el esperma debe aparecer como una bolita de aspecto "esponjoso". Resuspender suavemente los espermatozoides mediante trituración con una pipeta de transferencia de gran calibre o mediante suaves golpecitos manuales en el tubo ("chasquido de dedos"). Una vez resuspendidos uniformemente, transfiéralos a un nuevo tubo de fondo redondo. Utilice 10-20 μL de la suspensión espermática para contar y evaluar la motilidad. Diluir los espermatozoides en MW para su uso.
   NOTA: Para la mayoría de los experimentos que involucran la capacitación de espermatozoides en ratones, se utiliza una concentración final de 5-10 millones de espermatozoides/ml MW. El protocolo de imagen descrito aquí no requiere la capacitación de los espermatozoides, aunque es necesario que los espermatozoides adquieran la capacidad de someterse a una exocitosis acrosómica fisiológicamente relevante. Se podría estudiar la exocitosis patológica o la exocitosis inducida a través de reactivos como un ionóforo de calcio sin capacitar a los espermatozoides. Además, se podrían explorar los posibles cambios en el calcio acrosómico en células no capacitadas en respuesta a diversos estímulos.
5. Utilice los espermatozoides dentro de las 3-5 horas posteriores a la recolección, manteniendo el tiempo lo más corto posible y consistente entre los ensayos experimentales.
6. Realice todos los pasos de recolección y lavado a 37 °C utilizando medio MW, empleando métodos para minimizar el daño a la membrana. Esto incluye el uso de pipetas de transferencia de plástico de gran calibre o puntas de pipeta de orificio grande, que se recomiendan para su uso durante todas las etapas del procedimiento.

2. Recubrimiento de poli-D-lisina de placas de cubreobjetos para imágenes

NOTA: Los platos de poli-D-lisina (PDL) deben prepararse frescos antes de cada experimento.

1. Dispensar una gota de 0,5 μL de PDL (0,5 mg/mL, ver Tabla de Materiales) en el centro de un cubreobjetos.
2. Con una punta graduada de 10 μL, unte la gota de PDL a través del cubreobjetos (patrón entrecruzado como se muestra en la Figura 1B).
3. Dejar secar a 37 °C durante 10 min. Mantener la vajilla recubierta de PDL tapada y a 37 °C hasta su uso.

3. Tracción capilar, carga para inflar

1. Tire de los capilares de vidrio de borosilicato (diámetro exterior, 2 mm, diámetro interior, 1,56 mm, consulte la tabla de materiales) utilizando los siguientes ajustes: Calor: 330, Tracción: 250, Velocidad: 250 y Tiempo: 70. Este paso debe optimizarse para el extractor específico en uso.
2. Antes de cada experimento, cargue un solo capilar con la solución estimulante que contenga 3-5 veces la concentración del estimulante (para tener en cuenta la rápida difusión de la solución al inhalar). Antes de llenar, use pinzas finas para abrir la punta capilar a aproximadamente 1-2 mm del extremo. Esto debe producir un diámetro de abertura de ∼5 μm. No se requiere pulido con calor.
3. Con una pipeta de transferencia de plástico delgada, inyecte lentamente la solución estimulante en el capilar hasta que tres cuartas partes de su longitud estén llenas.
4. Elimine las burbujas de aire que se formen durante el llenado moviendo suavemente el capilar.
5. Monte el capilar lleno en el micromanipulador (consulte la tabla de materiales).

4. Preparación de la entrega de estimulación para inhalar

NOTA: Para minimizar el riesgo de lesiones al usuario, se deben usar gafas de seguridad durante la operación del procedimiento de inflado.

1. Configure la configuración del sistema de suministro de una sola celda para proporcionar un pulso de 10 s a 5 psi.
2. Conecte el capilar de borosilicato al soporte de pipeta del sistema de administración de una sola celda. Asegúrese de que los sellos estén apretados.
3. Mientras observa la punta capilar, aplique una bocanada corta de 2 s a 20 psi para asegurarse de que la solución se dispense realmente a través del extremo de la punta (una pequeña gota debe ser obvia al final de la punta).

5. Microscopía y adquisición de imágenes

NOTA: Hay varias marcas de microscopios disponibles y se pueden usar; Sin embargo, es deseable una velocidad de fotogramas mínima de 3 fotogramas/s. En cuanto al control de la temperatura y el ambiente, tenga en cuenta que la temperatura real del medio en el plato debe confirmarse, por ejemplo, utilizando un termómetro infrarrojo sin contacto.

1. Añadir 80 μL de espermatozoides diluidos en el centro de una placa de cubreobjetos de 35 mm recubierta de poli-D-lisina. Para la mayoría de los experimentos que involucran la capacitación de espermatozoides de ratones, se utiliza una concentración final de 5-10 millones de espermatozoides/ml.
2. Añadir lentamente a los espermatozoides 3 mL de medios base MW tibios (37 °C) suplementados con 10 mM de CaCl₂.
   NOTA: Se podrían realizar experimentos a temperatura ambiente para ralentizar los procesos celulares, pero es importante tener en cuenta que debido a que la capacitación está mediada por los intercambios de lípidos y la fluidez de los micro y macrodominios, se debe tener en cuenta que la capacitación fisiológicamente relevante y la exocitosis acrosómica son procesos dependientes de la temperatura.
3. Monta la placa con los espermatozoides en el microscopio (precalentado a 37 °C).
4. Excite el GCaMP3 con una línea láser de 488 nm y visualícelo con un filtro de paso de banda (BP) de 505-550 nm. Excite el mCherry con una línea láser de 555 nm y visualícelo con un filtro BP de 575-615 nm.
5. Con un micromanipulador (se recomienda fijar el manipulador a la mesa de aire en la que se instaló el microscopio), coloque la punta del capilar aproximadamente 100 μm hacia un lado y 5-10 μm por encima del plano de la célula de interés.
   NOTA: Las soluciones estimulantes se elaboran a 3-5 veces la concentración normal para compensar la rápida difusión que se produce en el volumen entre el capilar y la célula.
6. Inicie la secuencia de imágenes en el microscopio.
7. Tome imágenes de los espermatozoides a una alta velocidad de fotogramas, preferiblemente >10 fotogramas/s. En este caso, se utilizó un escáner resonante que permite obtener imágenes a 33 ms/fotograma.
8. Diez segundos después de iniciar la adquisición de imágenes en el microscopio, active el sistema de administración de una sola célula para iniciar la bocanada de estimulante de 10 s.
9. Visualice las celdas durante una duración de 10-15 min.
10. Con el sistema de administración de una sola célula, obtenga imágenes de varias células de una sola antena de acuerdo con las ubicaciones proporcionadas en la Figura 1B.
    NOTA: Los espermatozoides no tratados/no estimulados bajo el microscopio deben aparecer mayoritariamente rojos, con una baja intensidad de la señal verde. Las cabezas de los espermatozoides deben estar unidas al cubreobjetos, y los espermatozoides vivos se pueden identificar por sus colas en movimiento. En los espermatozoides que se someten a EA, la señal verde de GCaMP3 aumentará inicialmente, y tanto la señal roja mCherry como la señal verde GCaMP3 desaparecerán si se completa AE, como se ilustra en la Figura 2. La reducción de la fluorescencia de mCherry proporciona un indicador más específico del momento en que comienza la EA, ya que los cambios en las concentraciones de Ca²⁺ causarán continuamente cambios en la intensidad de la fluorescencia de GCaMP3.

6. Análisis de imágenes y datos

NOTA: El análisis de imágenes sin conexión se realiza utilizando ImageJ (consulte la Tabla de materiales). Anteriormente, se informaron varios pasos intermedios en el proceso que conduce a la EA, incluido el aumento acrosómico del calcio (ACR) y la fusión completa de la membrana. Esto último conduce a la pérdida de fluorescencia mCherry y, por lo tanto, representa un EA completo. En algunas células, se observan señales similares a los eventos previos a la espiga del pie (PSF) cuando se utilizan enfoques amperométricos en estudios de exocitosis (para más detalles, véase²). Hay varios métodos opcionales disponibles para analizar los datos sin procesar de AcroSensE para cuantificar ACR, AE y sus pasos intermedios. A continuación se describen algunos de los métodos analíticos básicos.

1. Dependiendo de la extensión de archivo del sistema de microscopio específica, utilice la herramienta de canal dividido (Imagen > Colores > Canales divididos) para generar ventanas individuales para los canales GCaMP3 y mCherry.
2. Sincronice las ventanas individuales con la herramienta "Sincronizar ventana" (Analizar herramientas > > Sincronizar ventanas).
3. Seleccione una región de interés (ROI) alrededor de la cabeza del espermatozoide en el canal rojo para incluir la región acrosómica (Figura 3A, B). La herramienta de sincronización permite aplicar automáticamente la misma selección de área en el canal verde, en el que los espermatozoides aún son demasiado tenues para ser visibles.
4. Elija el complemento "Z Profiler" (Complementos > pilas > Z Profiler) o "Analizador de series temporales" (Complementos > pilas > Analizador de series temporales) para trazar el cambio en la intensidad de fluorescencia en función de los fotogramas/tiempo para cada uno de los dos canales.
5. Copie los datos en un software de hoja de cálculo (por ejemplo, Microsoft Excel) para trazarlos y analizarlos más a fondo.
   NOTA: Una vez que los datos se copian en una hoja de cálculo, se pueden extraer varios parámetros para su análisis, incluidos los siguientes, como se ilustra en la Figura 4.
   1. Hora de inicio de Fusion Pore (FP): mide el tiempo desde el punto de tiempo 0 hasta el punto de tiempo en el que la señal GCaMP3 comienza a subir. Este parámetro indica el retraso entre la estimulación y la respuesta del ACR de los espermatozoides.
   2. Hora de inicio de AE: mide el tiempo desde el punto de tiempo 0 hasta el punto de tiempo en el que la señal mCherry comienza a decaer. Este parámetro indica el retraso entre la estimulación y la respuesta del EA de los espermatozoides. Este parámetro también podría utilizarse para calcular el retardo entre la formación de FP y la respuesta de EA.
   3. Amplitud máxima de FP: mide la señal de fluorescencia desde la base hasta el pico de la subida de la señal GCaMP3. Este parámetro indica el aumento total de la respuesta del ACR.
   4. Tasa de pérdida de mCherry: determine este parámetro mediante un ajuste lineal o exponencial en la sección de la pérdida de la señal de mCherry (como se indica por la "pendiente" en la Figura 4B).
      NOTA: Alternativamente, determine la tasa de decaimiento por el método de la señal residual (R) en varios puntos de tiempo (por ejemplo, R60: tiempo de duración en segundos a una señal residual del 60% desde la línea de base de la señal mCherry). Este parámetro se puede utilizar para cuantificar la velocidad a la que el contenido acrosómico se dispersa en AE.
   5. Disminución de la señal para la pérdida de mCherry: determine la diferencia de amplitud entre la intensidad de fluorescencia de mCherry basal y la señal después de EA. Este parámetro indica la cantidad total de contenido acrosómico disperso en AE.
   6. Grafique los cambios en la fluorescencia (F) para los canales rojo y verde como datos sin procesar, o normalícelos por la fluorescencia inicial (F0) y expréselos como ΔF/F0. Este último proporciona una mejor visualización de los cambios en rojo y verde en un solo gráfico (por ejemplo, consulte la Figura 3D y la Figura 3H).
      NOTA: Finalmente, los diferentes parámetros medidos se pueden comparar entre diferentes condiciones para determinar la relación entre los cambios en la concentración de calcio acrosómico y la EA. Para ver ejemplos de varias comparaciones de condiciones experimentales, véase la referencia².

Resultados

La Figura 2 proporciona una ilustración simplificada que muestra la secuencia de cambios de fluorescencia esperados después de la estimulación exitosa de los espermatozoides. El panel superior de la Figura 2 ilustra los cambios en la intensidad de la fluorescencia de GCaMP3, donde la señal es inicialmente tenue (las concentraciones de calcio acrosómica basales son más bajas que las de GCaMP3 KD), y tras la entrada de iones de calcio a través de l...

Discusión

Aquí, se describe un método basado en microscopía para utilizar el modelo de ratón AcroSensE recientemente generado para el monitoreo y análisis en tiempo real de una sola célula de la interacción entre la dinámica del calcio acrosómico y los pasos intermedios que conducen a la EA. Junto con los enfoques genéticos fácilmente disponibles, como el cruzamiento con otros modelos genéticos de ratón o la edición de genes, este modelo y método proporcionan un poderoso sistema para estudiar el papel de varios comp...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100x oil objective	Olympus Japan	UPlanApo,
2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin	Sigma	C0926
35 mm coverslip dish, 1.5 thickness	MatTek Corp.	P35G-1.5-20-C
5 mL round-bottomed tube	Falcon	352054
Borosilicate glass capilarries	Sutter Instrument Co. CA USA	B200-156-10
CaCl2	Sigma	C4901
Confocal microscope	Olympus Japan	Olympus FluoView
Glucose	Sigma	G7528
Graduated tip	TipOne, USA Scientific
HEPES	Sigma	H7006
ImageJ	National Institutes of Health		https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html
KCl	Sigma	P9541
Lactic acid	Sigma	G5889
Live-Cell Microscope Incubation Systems	TOKAI HIT Shizuoka, Japan	Model STX
MgCl2	Sigma	M8266
Micropipette Puller	Sutter Instrument Co. CA USA	Model P-97
NaCl	Sigma	S3014
NaHCO3	Sigma	S6297
Plastic transfer pipette	FisherBrand	13-711-6M
Poly-D-lysine	Sigma	P7280
Pyruvic acid	Sigma	107360
Single cell delivery system	Parker, Hauppauge, NY	Picospritzer III