Análisis cualitativo y cuantitativo de la producción de sideróforos a partir de Pseudomonas aeruginosa

Resumen

Este protocolo proporciona análisis cualitativos y cuantitativos de sideróforos totales, pioverdina y pioquelina de Pseudomonas aeruginosa.

Resumen

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) es conocida por su producción de una amplia gama de factores de virulencia para establecer infecciones en el huésped. Uno de estos mecanismos es la eliminación de hierro a través de la producción de sideróforos. P. aeruginosa produce dos sideróforos diferentes: pioquelina, que tiene menor afinidad quelante del hierro, y pioverdina, que tiene una mayor afinidad quelante del hierro. Este informe demuestra que la pioverdina se puede cuantificar directamente a partir de sobrenadantes bacterianos, mientras que la pioquelina debe extraerse de los sobrenadantes antes de la cuantificación.

El método principal para analizar cualitativamente la producción de sideróforos es el ensayo en placa de agar sulfonato de cromo azurol (CAS). En este ensayo, la liberación del colorante CAS del complejo Fe³⁺-Colorante conduce a un cambio de color de azul a naranja, lo que indica la producción de sideróforos. Para la cuantificación de los sideróforos totales, los sobrenadantes bacterianos se mezclaron en proporciones iguales con colorante CAS en una placa de microtitulación, seguido de un análisis espectrofotométrico a 630 nm. La pioverdina se cuantificó directamente a partir del sobrenadante bacteriano mezclándolo en proporciones iguales con 50 mM de Tris-HCl, seguido de un análisis espectrofotométrico. Un pico a 380 nm confirmó la presencia de pioverdina. En cuanto a la pioquelina, no fue posible la cuantificación directa del sobrenadante bacteriano, por lo que primero hubo que extraerla. El análisis espectrofotométrico posterior reveló la presencia de pioquelina, con un pico a 313 nm.

Introducción

Los organismos requieren hierro para realizar diversas funciones vitales, como el transporte de electrones^{y la} replicación del ADN. Se sabe que Pseudomonas aeruginosa, un patógeno oportunista gramnegativo, posee una variedad de factores de virulencia para establecer la infección en el huésped, entre los cuales uno de los mecanismos es la formación de sideróforos². Durante las condiciones de agotamiento del hierro, P. aeruginosa libera moléculas especializadas llamadas sideróforos, que apagan el hierro del entorno circundante. Los sideróforos quelan el hierro extracelularmente, y el complejo férrico-side....

Protocolo

Todos los aislados bacterianos de P. aeruginosa se obtuvieron de laboratorios de microbiología médica de Vadodara y Jaipur, India. Todos los aislados clínicos seleccionados se manipularon en el Gabinete de Bioseguridad (BSL2) y se tuvo sumo cuidado al manipular los aislados bacterianos durante los experimentos. Los detalles comerciales de todos los reactivos/soluciones se proporcionan en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del colorante de sulfonato de cromo azurol (CAS) y medios de agar

1. Prepare el colorante CAS (100 ml) con la siguiente composición:
   1. Disolver 60 mg de CAS en 50 ml de agua destil....

Discusión

Este protocolo permite a los investigadores cuantificar los sideróforos totales y dos sideróforos diferentes de P. aeruginosa, a saber, pioverdina y pioquelina, a partir del sobrenadante libre de células bacterianas. En el ensayo de placas de agar CAS, el colorante CAS y los iones Fe³⁺ forman un complejo. Cuando las bacterias producen sideróforos, apagan los iones Fe³⁺ del complejo CAS-Fe³⁺, lo que provoca un cambio de color alrededor del crecimiento bacteriano. Este cambio d.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar Agar, Type I	HIMEDIA	GRM666
8-Hydroxyquinoline	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome azurol sulfonate	HIMEDIA	RM336-10G
Citric acid	Merck	100241
Dextrose monohydrate	Merck	108342
Dichloromethane	Merck	107020
Ferric chloride hexahydrate	HIMEDIA	GRM6353
Glass Flasks	Borosil	5100021
Glass Test-tubes	Borosil	9820U05
Hydrochloric acid	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimal Medium Salts	HIMEDIA	G013-500G
Magnesium Sulphate	Qualigens	10034
MultiskanGO UV Spectrophotometer	Thermo Scientific	51119200
Peptone Type I, Bacteriological	HIMEDIA	RM667-500G
PIPES free acid	MP Biomedicals	190257
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	1048731000
Proteose peptone	HIMEDIA	RM005-500G
Shimadzu UV-Vis Spectrophotometer	Shimadzu	2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Sodium chloride	Qualigens	15915