Entrenamiento de conejos de laboratorio para refinar los procedimientos rutinarios de cría

Resumen

Se desarrollaron protocolos de entrenamiento que incluían refuerzo positivo para los procedimientos rutinarios de cría en conejos y demostraron ser exitosos, ya que los conejos mostraron de manera confiable los comportamientos entrenados en el examen general semanal. Recoger los conejos con la caja de transporte era menos aversivo que la técnica de manipulación convencional.

Resumen

Se requieren técnicas de manejo y entrenamiento no aversivos para animales de laboratorio para facilitar los procedimientos experimentales y rutinarios de cría, mejorando tanto el bienestar animal como la calidad científica. El entrenamiento con clicker se utilizó para desarrollar protocolos de entrenamiento para conejos con el fin de refinar los estresantes procedimientos de cría de rutina generalmente asociados con levantarlos (es decir, ser levantados del suelo) / restringirlos (es decir, ser sostenidos en los brazos de un humano). Trece conejas blancas de Nueva Zelanda fueron entrenadas durante tres semanas. Todos los conejos aprendieron los comportamientos objetivo predefinidos: siguieron el palo objetivo, saltaron a la báscula, entraron en una caja de transporte y se encabritaron mientras colocaban sus patas delanteras en la mano del entrenador. Además, diez animales saltaron del suelo al regazo del entrenador sentado y permitieron que el entrenador levantara sus patas de la superficie mientras estaban sentados en el regazo del entrenador. Para algunas personas, los protocolos tuvieron que adaptarse mediante medidas provisionales adicionales. Al final del entrenamiento, los conejos mostraron de forma fiable los comportamientos de gol esperados, incluso después de pausas de entrenamiento cortas y largas. Con pocas excepciones, una persona conocida que no fuera el entrenador podía obtener los comportamientos objetivo de los conejos (generalización), aunque se requerían sesiones adicionales para la generalización. En la prueba de enfoque voluntario, los conejos prefirieron interactuar con el entrenador en la^1ª prueba, pero pasaron tanto tiempo con una persona desconocida como con el entrenador en la^2ª prueba. Las observaciones conductuales sugirieron que recoger a los conejos con la caja de transporte, como se describe en el protocolo, en lugar de sujetarlos con el pescuezo y levantarlos sobre el brazo, era menos aversivo. Con todo, los protocolos de entrenamiento fueron factibles y pueden servir como una estrategia de refinamiento en las instalaciones de animales de laboratorio. En aras del bienestar animal, los protocolos de adiestramiento deben aplicarse siempre que sea posible.

Introducción

Entre 2015 y 2019, se utilizaron más de 49 millones de animales con fines científicos en la Unión Europea (y Noruega); De ellos, 1.745.037 (3,5 %) eran conejos¹. Los conejos se utilizan principalmente para la investigación regulatoria (por ejemplo, control de calidad, toxicidad y otras pruebas de seguridad, incluida la farmacología) y la producción rutinaria de sustancias biológicas (por ejemplo, productos a base de sangre)². Aunque se están haciendo esfuerzos para reemplazar los experimentos con animales por métodos sin animales, el uso de animales sigue siendo necesario para algunos de estos fines. Siempre que un experimento con animales no pueda ser reemplazado, es crucial reducir el número de animales y refinar las condiciones experimentales, así como las de alojamiento y cría para minimizar el sufrimiento. Russel y Burch describieron esta estrategia como el principio de las 3R (reemplazar, reducir, refinar) en 1959^{3 y} , en 2010, se implementó en la Directiva 2010/63/UE relativa a la protección de los animales de laboratorio utilizados para fines científicos⁴. El papel del refinamiento, a veces referido como "Cenicienta" de las 3R⁵, ha ganado cada vez más importancia. Si bien la sustitución y la reducción son estrategias a largo plazo para alcanzar el objetivo final de la Directiva de sustituir completamente los experimentos con animales, el perfeccionamiento permite la mejora inmediata del bienestar animal⁵, lo que a su vez tiene el potencial de mejorar la calidad científica⁶. Las partes esenciales del perfeccionamiento son el manejo y la formación de los animales, como se señala en el anexo III de la Directiva 2010/63/UE. La Directiva estipula que los animalarios deben diseñar programas de habituación y adiestramiento de los animales de laboratorio adaptados a la especie, al procedimiento y al proyecto⁴. El Apéndice A del ETS Nº 123 sugiere que el personal de los animales de laboratorio pasa tiempo "hablando, manipulando, entrenando y acicalando a los animales"⁷.

Algunos procedimientos de manipulación causan estrés, especialmente para los animales de presa terrestres como los conejos. Algunos ejemplos son ser acorralados, restringidos (es decir, agarrados por un ser humano, sostenidos en los brazos de un humano o inmovilizados por un dispositivo) y levantados (es decir, recogidos del suelo) para una inspección de salud o procedimientos experimentales⁸. Una encuesta centrada en conejos domésticos reveló que entre el 57 % y el 61 % de ellos tenían problemas al ser levantados ^9,10 y algunos incluso mostraban agresividad relacionada con el miedo (es decir, mordiscos)¹¹. Esto enfatiza la necesidad de técnicas de manejo y entrenamiento suaves. Ya se ha demostrado para otros pequeños mamíferos, como los ratones, que las técnicas de manejo suave disminuyen la ansiedad¹². Además, el manejo suave en combinación con el entrenamiento reduce el estrés, la ansiedad y el comportamiento similar a la depresión en ratones¹³. En macacos rhesus y chimpancés, las medidas fisiológicas relacionadas con el estrés se vieron menos afectadas cuando fueron entrenados previamente en un procedimiento^14,15. Se puede suponer que si un animal puede optar por participar en el entrenamiento de forma voluntaria, puede participar activamente y controlar la situación, lo que mejora el bienestar del animal y también puede contribuir a obtener datos científicos más sólidos y fiables¹⁶.

Muchos procedimientos de entrenamiento animal se basan en los principios del condicionamiento operante, en particular el uso del refuerzo positivo y la formación 17,18,19. El condicionamiento operante requiere que un animal provoque comportamientos que luego pueden aumentar^{o disminuir.} Hay cuatro contingencias comunes que se utilizan para describir el condicionamiento operante: el refuerzo positivo y negativo, así como el castigo positivo y negativo ^21,22. En los conejos, el castigo positivo se utiliza cuando una persona se acerca (estímulo no deseado) a un animal para alejarlo o acercarlo a un lugar en particular²³. En el contexto del manejo de un conejo en la mesa de examen, un ejemplo de refuerzo negativo es la eliminación de la presión (estímulo no deseado) en el cuerpo del conejo cuando el conejo se queda quieto; Un ejemplo de castigo negativo es retirar una recompensa de comida (estímulo deseado) cuando el conejo comienza a luchar. Ni el castigo positivo/negativo ni el refuerzo negativo son recomendables en el adiestramiento de animales. El castigo causa afectos emocionales negativos²⁴, como la angustia como se muestra en los perros²⁵. En cambio, el refuerzo positivo debe ser el método de elección cuando se entrenan animales^25,26. El entrenamiento de refuerzo positivo (PRT, por sus siglas en inglés) significa que se proporciona un estímulo deseable (por ejemplo, una recompensa de comida) después de que el animal mostró un comportamiento deseado, lo que aumenta la probabilidad de que el animal vuelva a mostrar el comportamiento deseado en^{el futuro.} La PRT a menudo implica la aplicación de un reforzador condicionado. Un reforzador condicionado (reforzador secundario) suele ser un estímulo neutro, como un sonido, que el animal aprende a asociar con un reforzador incondicionado (reforzador primario, por ejemplo, recompensa alimenticia)²⁸. Después de que el animal muestra el comportamiento deseado, se presenta inmediatamente el reforzador condicionado, seguido de la presentación de la recompensa alimenticia²⁶. Un ejemplo bien conocido de PRT es el entrenamiento con clicker, donde se utiliza un clicker para producir un clic como reforzador secundario²⁶.

El entrenamiento debe seguir patrones predecibles, lo que se logra mediante el diseño de un protocolo de entrenamiento. El protocolo de entrenamiento describe cómo se puede alcanzar un comportamiento objetivo paso a paso (es decir, la conformación del comportamiento), mientras que cada paso está definido por criterios objetivos y debe lograrse fácilmente²⁶. Si el entrenamiento sigue un protocolo particular, es posible que el personal de animales de laboratorio alterne con el entrenamiento de los animales. Es importante tener en cuenta que el personal necesita conocer los principios de las técnicas de aprendizaje y entrenamiento para poder aplicarlas correctamente²⁶. El entrenamiento de animales a menudo incorpora la configuración del comportamiento. El modelado del comportamiento a mano fue utilizado deliberadamente por primera vez por Skinner y sus colegas a principios de la década de 1940²⁹. En contraste, en trabajos anteriores, Skinner se centró más bien en "hacer pequeños cambios en el entorno físico con el fin de implementar un programa de aproximación sucesiva"²⁹. En un artículo publicado en Scientific American, explicó que reforzar un comportamiento aumenta la probabilidad de que el comportamiento se repita, lo que "hace posible moldear el comportamiento de un animal casi como un escultor da forma a un trozo de arcilla"³⁰. Desde entonces, la conformación ha experimentado una creciente importancia para los animales en cautiverio 29,30,31,32. Para reproducir y mejorar la conformación de los protocolos, es crucial evaluar los protocolos de manera sistemática y objetiva 33,34,35,36.

Una revisión sistemática y meta-análisis recientemente publicada por Pfaller-Sadovsky et al. encontró que el refuerzo condicionado se estudió con mayor frecuencia en caballos y perros, aunque también se investigaron gatos, ganado, peces, cabras y primates no humanos³⁷. En la ciencia de los animales de laboratorio, el PRT se utiliza ampliamente para los primates no humanos 38,39,40 y los perros^41,42. Además, cerdos⁴³, cabras⁴⁴ e incluso pequeños mamíferos, como ratones¹³ y ratas 45,46,47, fueron entrenados con éxito utilizando un clicker en el laboratorio. Hasta donde saben los autores, la introducción de PRT para conejos de laboratorio solo se ha reportado raramente^{hasta ahora 48}; La literatura existente revisada por pares publicada hace varias décadas está desactualizada y no cumple con los criterios de la investigación ética moderna. Aunque poca información no revisada por pares sugiere que los conejos pueden ser entrenados con éxito utilizando PRT⁴⁹, parece haber una falta de conocimiento sobre los protocolos de entrenamiento adecuados para los conejos que se alojan en instalaciones de animales de laboratorio. Las razones subyacentes pueden variar. Por ejemplo, es posible que las técnicas de capacitación utilizadas no se describan en detalle en los artículos de investigación o que se generen datos para la investigación regulatoria y, por lo tanto, no se publiquen. Además, es posible que los conejos no sean el foco principal de la investigación de refinamiento, ya que otras especies, como los ratones y las ratas, se utilizan con mayor frecuencia en la investigación. Dado que los conejos pueden enmascarar el estrés y el malestar extremadamente bien, su estado emocional negativo cuando se les manipula a menudo puede pasar desapercibido. El tamaño de un conejo permite a los humanos sujetar a estos animales para procedimientos, mientras que otras especies, como los primates no humanos, pueden no ser sostenidos con las manos para intervenciones similares sin resultar gravemente heridos⁵⁰. Sin embargo, estos hechos no deben impedir el desarrollo o la difusión de protocolos de PRT para conejos de laboratorio.

En cuanto a los beneficios potenciales del PRT, se realizaron los primeros intentos de llenar el vacío de conocimiento sobre los protocolos de entrenamiento adecuados para los conejos de laboratorio. Para facilitar los procedimientos de rutina, como la manipulación, las inspecciones sanitarias y el pesaje, se desarrollaron protocolos de entrenamiento y se evaluó su viabilidad para las hembras de conejo blanco de Nueva Zelanda. Se realizaron comparaciones para evaluar si la técnica de manejo alternativa descrita en los protocolos de entrenamiento era menos aversiva que la técnica de manejo convencional y si los protocolos de entrenamiento pueden servir como medidas de refinamiento. En la Figura 1 se muestra el cronograma del presente estudio.

Mantenimiento de animales

Trece conejos blancos hembras de Nueva Zelanda se obtuvieron de fuentes comerciales (llegaron a las instalaciones de animales a la edad de aproximadamente siete semanas de edad). Los animales estaban libres de todos los patógenos virales, bacterianos y parasitarios enumerados en las recomendaciones de FELASA⁵¹. Se utilizó ropa y equipo de protección (guantes, mascarillas, redecillas para el cabello) al llevar a cabo los pasos del presente protocolo. Un grupo de seis y un grupo de siete animales se alojaron juntos en un corral de suelo de 2,8 m × 2,8 m (vivienda en el suelo), respectivamente. El suelo estaba cubierto con material de cama de madera fino y escamoso (esterilizado en autoclave). Además, el material de anidación y la lana de papel estaban esparcidos sobre la ropa de cama. Tres casas de plástico con dos aberturas cada una (37 cm × 60 cm; altura 30 cm) y un túnel de plástico (longitud: 58 cm; diámetro: 16 cm) servían como refugios. Además, se proporcionaron artículos de enriquecimiento como bloques de madera para roer, bolas de heno y sauce, y bolas de bocadillos rellenas de gránulos de comida, que se caen al mover la pelota. Los conejos tenían libre acceso a agua del grifo, comida granulada y heno esterilizado en autoclave, así como paja. Más información sobre alimentos y artículos de enriquecimiento se enumeran en la Tabla de Materiales. La sala de los animales se limpiaba los jueves.

Los conejos se mantuvieron en condiciones estándar (temperatura ambiente y humedad relativa como media ± desviación estándar: 20,3 ± 0,4 °C y 50 ± 5 %) en un ciclo de luz:oscuridad de 12:12 h (luz artificial con incidencia adicional de luz diurna). Se encendió una radio 30 minutos antes del inicio de la fase de luz durante aproximadamente 8 h para habituar a los conejos a los ruidos ambientales.

Protocolo

El mantenimiento de los animales fue aprobado por la Autoridad Estatal de Berlín ("Landesamt für Gesundheit und Soziales", número de permiso: ZH3 - Instituto Federal Alemán para la Evaluación de Riesgos, Berlín). Los protocolos de capacitación se desarrollaron en el marco de la cría rutinaria de animales para perfeccionar procedimientos como el manejo, la inspección sanitaria y el pesaje. Dado que los protocolos de entrenamiento no causaron ningún dolor, sufrimiento o daño y todas las observaciones se realizaron en el contexto de la cría rutinaria de animales, este estudio no se consideró un experimento con animales según la legislación europea.

1. Requisitos generales para la formación

NOTA: Los siguientes puntos son generalmente obligatorios para el entrenamiento de animales, independientemente del presente protocolo.

1. Marque claramente a los animales para su identificación.
2. Asegúrate de tener una recompensa de alta calidad, por ejemplo, comida muy sabrosa.
3. Defina el plan de entrenamiento que incluya todos los pasos hacia el comportamiento objetivo, es decir, el comportamiento deseado que debe mostrar el animal.
   NOTA: El comportamiento del objetivo se forma paso a paso, mientras que cada paso está definido por criterios objetivos y debe lograrse fácilmente.
4. Defina si los animales deben tener éxito en realizar el 80% o el 100% de los pasos de entrenamiento antes de continuar con el siguiente paso.
5. Prepare la documentación (por ejemplo, Tabla complementaria 1).
6. No entrene a los animales cuando tengan prisa y tenga cuidado con los gestos, el tono de voz y la velocidad de movimiento, es decir, hable suave y tranquilamente, muévase lenta y predeciblemente.
7. Pruebe los pasos que se entrenaron en la capacitación anterior.
8. No entrene a un animal cuando el estado de salud general del animal esté deteriorado y/o el animal no esté interesado en interactuar con el entrenador.

2. Rutinas de entrenamiento para el presente protocolo

NOTA: Se definieron las siguientes rutinas de entrenamiento para el presente protocolo.

1. Montar la pista de entrenamiento en la sala/corral de los animales (Figura 2) y, en función del comportamiento objetivo a entrenar, colocar la báscula o la caja de transporte (suelo de 30 cm × 50 cm; puerta de 27 cm × 25,5; con una abertura en la tapa de 16 cm × 39 cm) en la arena.
2. Coloque la báscula y la caja de transporte fuera de la arena para familiarizar a los conejos con estos objetos novedosos antes de que se entrenen los comportamientos objetivo "pesaje" y "caja de transporte".
3. Para los comportamientos de meta (ver pasos 6-9), lleve al conejo al campo de entrenamiento, como se describe en el paso 5.7.
4. Siéntese en el suelo o use un taburete/escalón bajo para sentarse en el campo de entrenamiento.
5. Entrene los comportamientos objetivo uno tras otro, en el orden descrito en el protocolo y no simultáneamente. Haga una excepción si un animal no logra aprender un paso de un comportamiento objetivo en dos días consecutivos, en este caso, entrene el siguiente comportamiento objetivo simultáneamente. Cambiar el orden de las conductas objetivo si esto facilita el proceso de entrenamiento para un individuo.
6. Después de la habituación y la introducción del clicker, comience a entrenar a todos los animales en el^{primer paso del} comportamiento de la meta "siguiendo el objetivo" (es decir, la pelota al final del palo objetivo se define como objetivo). Tenga en cuenta que, dependiendo de su rendimiento individual, pueden alcanzar diferentes niveles de entrenamiento en este día. Continuar el entrenamiento de acuerdo con el progreso individual de los animales en los días siguientes.
7. Programe una sesión de entrenamiento (por ejemplo, aproximadamente 30 minutos para un grupo con seis o siete animales) para cada día de trabajo durante la semana.
   NOTA: La sesión de entrenamiento comienza cuando el entrenador está en la sala de animales/corral y está preparado para comenzar el entrenamiento. Una sesión termina cuando ninguno de los conejos participa en el entrenamiento (ya) o todos los conejos alcanzaron el paso final de entrenamiento del comportamiento objetivo para ser entrenados en esta sesión. Comience cada sesión de entrenamiento con el último paso exitoso del protocolo. Una sesión consta de al menos uno o más ensayos por animal.
8. Comience una prueba pidiéndole al animal que realice un paso de entrenamiento en particular (es decir, el paso 3.1 después de que el conejo aprendió a tocar el objetivo con la nariz / boca) y finalice la prueba cuando el animal ya no participe en el entrenamiento (más) o el animal haya alcanzado el paso final de entrenamiento del comportamiento objetivo a entrenar. Al final del entrenamiento, abre la arena de entrenamiento y guía al conejo fuera de la arena; A continuación, sujeta el palo de objetivo (con el objetivo mirando hacia el techo) y el cuenco de recompensa delante del cofre.
9. Programe la capacitación antes de la alimentación, la limpieza, los tratamientos o los procedimientos experimentales.
10. Use un tazón de recompensa con un clicker integrado (Figura 3, Archivo de codificación suplementario 1) y, para algunos comportamientos de meta, un palo de objetivo adicional.
11. Llene el tazón de recompensa con alimentos sabrosos, por ejemplo, semillas de girasol y golosinas de forrajeo a base de granos.
    NOTA: Los conejos son folívoros y estos ejemplos de recompensas no son óptimos; Sin embargo, debido a las restricciones de higiene en el animalario de laboratorio, eran las mejores alternativas disponibles para estos animales. Si es posible, se deben preferir las hierbas frescas como recompensa alimentaria. Tenga en cuenta que una recompensa solo es una recompensa si el conejo realmente la favorece.
12. Asegúrese de sostener siempre el tazón de recompensa en la misma posición, por ejemplo, frente al cofre, y comience a mover el tazón de recompensa hacia los conejos solo después del clic. Excepto por el comportamiento de objetivo "levantarse" y "saltar en el regazo", sostenga el palo de objetivo en una mano y el tazón de recompensa en la otra.
13. Presente la recompensa en el lugar donde estaba la nariz/boca del conejo cuando se mostró correctamente el comportamiento deseado.
14. Ten cuidado de que el conejo solo coma una pequeña cantidad de comida al presentar la recompensa.
15. Si un conejo muestra el comportamiento deseado al menos cuatro veces en un bloque de cinco intentos (tasa de éxito del 80%), continúe con el siguiente paso. Si un animal no es capaz de realizar el siguiente paso (es decir, no puede realizar el paso más de una vez), vuelva al paso anterior del protocolo. Si fue necesario volver a un paso anterior o un conejo no participa en el entrenamiento, revise los protocolos de entrenamiento (por ejemplo, defina pasos de entrenamiento más pequeños), elija otra recompensa de alimento (más apetecible) o verifique las habilidades de entrenamiento del entrenador.
16. Si un conejo realiza correctamente el paso final de entrenamiento de un comportamiento objetivo, termine las sesiones de entrenamiento para este conejo el mismo día.
17. Imprima la hoja de documentación (Archivo Complementario 1), los protocolos de entrenamiento detallados, así como los protocolos de entrenamiento simplificados (Archivo Complementario 2) y adjúntelos a un portapapeles o ábralos en una tableta. Utilice la hoja de documentación para anotar los pasos de entrenamiento alcanzados por los animales individuales en cada sesión.

3. Condicionamiento/habituación contextual

NOTA: Las sesiones de acondicionamiento contextual / habituación son realizadas diariamente por el entrenador y los cuidadores de animales durante aproximadamente 15 minutos por grupo de conejos durante un período de cinco días consecutivos (de lunes a viernes).

1. Háblale suavemente a los conejos.
2. Ofrezca recompensas de comida sabrosa.
   NOTA: Tenga en cuenta que los cambios repentinos en la dieta pueden causar problemas digestivos en los conejos. Por lo tanto, introduzca lentamente la nueva recompensa de comida.
3. Mueve el cuenco de recompensa lleno de comida sabrosa hacia los conejos y deja que coman de él.
4. Toca suavemente a los conejos alrededor del cuello, los hombros, la espalda y la grupa sin sujetarlos.

4. Presentación del clicker

NOTA: Comportamiento de la meta: Acércate al entrenador y come la recompensa del tazón después del click. El objetivo es que el conejo asocie la recompensa de comida con el clic, es decir, el conejo se come la recompensa de comida después del clic.

1. Deja que el conejo se acerque.
2. Haga clic una vez y mueva el tazón de recompensa hacia el conejo (conocido como clic y golosina o C y T).
3. Repita el paso 4.2 diez veces. Al hacer clic por décima vez, espere un segundo antes de que se presente la recompensa y observe el comportamiento del conejo.
   NOTA: Si el animal busca la recompensa inmediatamente después del clic, se puede suponer que el condicionamiento del reforzador secundario fue exitoso.
4. Repita los pasos 4.1.-4.3. Al día siguiente, si un conejo no comió la comida, recompensa después del clic al menos ocho veces.

5. Seguir el objetivo

NOTA: Comportamiento objetivo: Siga y toque al objetivo con la nariz o la boca. Las conductas meta en las secciones 6-9 son modificaciones de la conducta meta presentada en la sección 5.

1. Coloca el objetivo cerca de la nariz o la boca del conejo.
   NOTA: La bola en el extremo del palo objetivo se define como objetivo.
   1. C y T cuando el conejo toca el objetivo con la nariz/boca.
      NOTA: Asegúrese de que la nariz / boca del conejo no toque el palo en ningún lugar indefinido que no sea la pelota.
   2. Elimina al objetivo del campo de visión del conejo mientras recompensas.
   3. Repita todos los pasos anteriores cinco veces hasta que el conejo haya realizado con éxito este paso al menos cuatro de cinco veces (tasa de éxito del 80%).
2. Coloque el objetivo en un lugar diferente donde pueda ser tocado con la nariz / boca mediante movimientos de cabeza sin mover todo el cuerpo.
   1. C y T cuando el conejo toca el objetivo con la nariz/boca y siga los pasos 5.1.2 y 5.1.3.
3. Coloque el objetivo a una distancia más amplia del conejo y deje que el conejo se estire hacia él.
   1. C y T cuando el conejo toca el objetivo con la nariz/boca y siga los pasos 5.1.2 y 5.1.3.
4. Aumenta aún más la distancia entre el objetivo y el conejo, lo que requiere que el animal dé un salto para llegar al objetivo.
   1. C y T cuando el conejo toca el objetivo con la nariz/boca y siga los pasos 5.1.2 y 5.1.3.
5. Coloque el objetivo justo en frente de la nariz o la boca del conejo para que el conejo pueda tocar el objetivo y luego aleje lentamente el objetivo del conejo. Asegúrate de que el conejo debe hacer un número variable de saltos para seguir al objetivo.
   NOTA: En un bloque de cinco intentos, la^1ª,^2ª,^3ª,^4ª y^5ª vez el conejo es recompensado después de 2, 1, 2, 3 y 2 saltos, respectivamente (en promedio: después de 2 saltos).
   1. C y T cuando los conejos hicieron el número requerido de saltos y sigue los pasos 5.1.2 y 5.1.3.
6. Repita el paso 5.5 y mueva el objetivo a través del pasillo entre los dos objetos.
   NOTA: Para este paso, dos objetos como túneles se colocan paralelos entre sí y forman un corredor.
   1. C y T cuando los conejos hicieron el número requerido de saltos y siga los pasos 5.1.2 y 5.1.3.
7. Repita el paso 5.5 y mueva el objetivo hacia la arena de entrenamiento para que el conejo entre en ella.
   1. C y T cuando los conejos hicieron el número requerido de saltos y siga los pasos 5.1.2 y 5.1.3.

6. Pesaje

NOTA: Comportamiento de meta: Permanezca en la báscula durante al menos un segundo. Si la superficie de la báscula es demasiado resbaladiza, se puede colocar una almohadilla antideslizante en la parte superior. Sin embargo, algunos conejos tienden a roer la almohadilla.

1. Conduzca al conejo con el palo de tiro hacia la escala como se describe en el paso 5.5.
   1. C y T cuando el conejo toca el objetivo con la nariz/boca.
   2. Elimina al objetivo del campo de visión del conejo mientras recompensas.
   3. Repita todos los pasos descritos anteriormente cinco veces hasta que el conejo haya realizado con éxito este paso al menos cuatro de cinco veces (tasa de éxito del 80%).
2. Mueva el objetivo ligeramente por encima de la escala para que el conejo lo pise con las patas delanteras y toque el objetivo con la nariz o la boca.
   1. C y T y siga los pasos 6.1.2 y 6.1.3.
3. Mueve el objetivo ligeramente más allá del centro de la escala para que el conejo lo pise con las patas delanteras y se estire sobre la escama para tocar el objetivo con la nariz o la boca.
   1. C y T y siga los pasos 6.1.2 y 6.1.3.
4. Mueva el objetivo más allá del centro de la escala para que el conejo se suba a la escala con las patas delanteras y traseras para tocar el objetivo con la nariz o la boca.
   1. C y T y siga los pasos 6.1.2 y 6.1.3.
5. Conduzca al conejo a la báscula como se describe en 4.4. y espere unos segundos antes de C y T.
   NOTA: En este paso, recompense al conejo después de sentarse durante una cantidad variable de tiempo en la báscula. En un bloque de cinco intentos, el^1º,^2º,^3º,^4º y^5º tiempo, el conejo es recompensado después de 0,5, 1,0, 2,0, 0,5 y 1,0 segundos, respectivamente (en promedio: 1,2 s). Mientras el conejo permanece quieto durante este tiempo, el peso se puede leer en la báscula. Si la báscula tarda más tiempo en estabilizarse y medir el peso, aumente el tiempo que el animal está sentado en la báscula.
   1. C y T y siga los pasos 6.1.2 y 6.1.3.

7. Introducción de la caja de transporte

NOTA: Comportamiento del objetivo: Entrar y salir de la caja de transporte. Para la sesión de entrenamiento, utilice una caja de transporte (suelo de 30 cm × 50 cm; puerta de 27 cm × 25,5 cm) con una abertura en la tapa (16 cm × 39 cm) cuya parte inferior esté cubierta con material de cama sucio.

1. Conduce al conejo con el palo de tiro hacia la caja como se describe en el paso 5.5.
   1. C y T cuando el conejo está frente a la entrada de la caja.
   2. Elimina al objetivo del campo de visión del conejo mientras recompensas.
   3. Repita todos los pasos descritos anteriormente cinco veces hasta que el conejo realice con éxito la tarea al menos cuatro de cinco veces (tasa de éxito del 80%).
2. Sostenga el palo objetivo a través de la abertura de la tapa y muévalo dentro de la caja, motivando así al conejo a entrar en la caja con las patas delanteras.
   1. C y T y siga los pasos 7.1.2 y 7.1.3.
3. Siga el paso 7.2 y lleve al conejo a la caja (es decir, todas las patas delanteras y traseras entraron en la caja).
   1. C y T y siga los pasos 7.1.2 y 7.1.3.
4. Siga el paso 7.3 y cierre la puerta de la caja durante unos segundos. A continuación, vuelve a abrir la puerta.
   1. C y T y siga los pasos 7.1.2 y 7.1.3.
5. Siga el paso 7.3 y cierre la puerta de la caja. Levante con cuidado la caja un poco (es decir, unos centímetros por encima del suelo). Vuelva a colocar la caja en el suelo y abra la puerta.
   1. C y T y siga los pasos 7.1.2 y 7.1.3.
6. Siga el paso 7.5. A continuación, saca al conejo de la caja con el palo de tiro.
   1. C y T y siga los pasos 7.1.2 y 7.1.3.

8. Crianza

NOTA: Comportamiento objetivo: Coloque las patas delanteras en la palma de la mano mientras se levanta. Para la sesión de entrenamiento, sostenga el palo de objetivo y el tazón de recompensa con la misma mano.

1. Coloque el objetivo por encima de la cabeza del conejo de modo que el conejo estire la nariz hacia arriba para tocar el objetivo con la nariz o la boca mientras todas las patas permanecen en el suelo.
   1. C y T.
   2. Elimina al objetivo del campo de visión del conejo mientras recompensas.
   3. Repita todos los pasos descritos anteriormente cinco veces hasta que el conejo haya realizado con éxito este paso al menos cuatro de cinco veces (tasa de éxito del 80%).
2. Coloque el objetivo por encima de la cabeza del conejo, como se describe en el paso 8.1. Después de que el conejo haya estirado la nariz hacia arriba, mueva el objetivo más hacia arriba para que el conejo levante las patas delanteras del suelo y toque el objetivo con la nariz o la boca.
   1. C y T y siga los pasos 8.1.2 y 8.1.3.
      NOTA: Si el conejo no realiza 8.2, se puede agregar un paso intermedio después de 8.2. Para ello, siga 8.2 y luego acérquese y toque las patas delanteras del conejo (superficie palmar) con la palma de la mano libre. C y T y siga los pasos 8.1.2 y 8.1.3.
3. Coloque la palma de la mano libre frente al conejo y mueva el objetivo por encima de la cabeza del conejo para que el conejo ponga las patas delanteras en la mano para tocar el objetivo con la nariz / boca.
   1. C y T después de un segundo y siga los pasos 8.1.2 y 8.1.3.
      NOTA: Mientras las patas delanteras descansan sobre la mano del entrenador, el abdomen del conejo se puede inspeccionar visualmente.

9. Saltar en el regazo

NOTA: Comportamiento objetivo: Saltar sobre el regazo del entrenador y permanecer sentado mientras lo tocan. Para los pasos 9.5-9.9, sostenga el palo de objetivo y el tazón de recompensa con la misma mano, ya que una mano debe tocar al conejo.

1. Lleve al conejo con el palo de tiro cerca del entrenador como se describe en el paso 5.5 del protocolo.
   1. C y T cuando el conejo toca el objetivo con la nariz/boca.
   2. Elimina al objetivo del campo de visión del conejo mientras recompensas.
   3. Repita todos los pasos descritos anteriormente cinco veces hasta que el conejo haya realizado con éxito este paso al menos cuatro de cinco veces (tasa de éxito del 80%).
2. Mueva el objetivo por encima de las patas del entrenador para que el conejo ponga las patas delanteras en las patas para tocar el objetivo con la nariz o la boca.
   1. C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.
3. Mueva el objetivo por encima de las patas y un poco más lejos del conejo para que el conejo ponga las patas delanteras en las patas y se estire hacia adelante para tocar el objetivo con la nariz o la boca.
   1. C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.
      NOTA: Si el conejo no logra realizar 9.4, se puede agregar un paso intermedio después de 9.3. Para esto, siga el paso 9.3 y luego atraiga al conejo con el tazón de recompensa al regazo. Cuando el conejo colocó las cuatro patas en el regazo, C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.
4. Mueva el objetivo por encima de las patas e incluso más lejos del conejo para que el conejo salte al regazo y toque el objetivo con la nariz o la boca.
   1. C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.
5. Siga el paso 9.4. y acariciar cuidadosamente al conejo con la mano libre desde el cráneo hasta la caudal (empezando por el hombro) mientras el conejo se sienta en el regazo.
   1. C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.
6. Siga el paso 9.4 y acaricie cuidadosamente las orejas del conejo con la mano libre desde el cráneo hasta la caudal mientras el conejo se sienta en el regazo.
   1. C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.
7. Siga el paso 9.4. y agarre suavemente una de las orejas del conejo para inspeccionar visualmente las orejas.
   1. C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.
8. Siga el paso 9.4. y acariciar una pata delantera o trasera con la mano libre mientras el conejo se sienta en el regazo.
   NOTA: Si el lado derecho del cuerpo del conejo mira hacia el entrenador y el lado izquierdo está lejos del entrenador, las patas izquierdas se pueden tocar suavemente (y viceversa). Asegúrate de entrenar ambos lados alternativamente.
   1. C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.
9. Siga el paso 9.4. y levante con cuidado una pata delantera o trasera con la mano libre mientras el conejo se sienta en el regazo.
   NOTA: Las garras se pueden inspeccionar cuando se levantan las patas. Asegúrate de entrenar ambos lados alternativamente.
   1. C y T y siga los pasos 9.1.2 y 9.1.3.

Discusión

Los protocolos de capacitación se desarrollaron para refinar los procedimientos de rutina, como el manejo, las inspecciones sanitarias y el pesaje en conejos de laboratorio. Su factibilidad se evaluó en este estudio exploratorio utilizando trece conejos blancos hembras de Nueva Zelanda. Los protocolos de entrenamiento podrían aplicarse de manera confiable para entrenar con éxito a los conejos. La mayoría de los conejos fueron capaces de aprender los comportamientos objetivo definidos en los protocolos de entrenamiento en menos de 3 semanas de período de entrenamiento, los recordaron después de descansos de entrenamiento de 1 semana y los generalizaron a otra persona que no fuera el entrenador. Se tuvieron que hacer pocas adaptaciones al protocolo para satisfacer las necesidades de los animales individuales. El principal hallazgo del presente estudio fue que la técnica de manejo refinada para recoger conejos, tal como se describe en los protocolos de entrenamiento, fue menos aversiva que la técnica de manejo convencional. Curiosamente, los conejos entrenados mostraron su comportamiento exploratorio no solo hacia el entrenador familiar, sino también hacia una persona desconocida en una prueba de enfoque voluntario.

Significado del objetivo

El objetivo sirvió de base para el presente protocolo de formación. Al introducir el objetivo, los animales aprendieron que su comportamiento afectaba al entorno y generaba consecuencias. La introducción del objetivo genera confianza entre el humano y el animal, como lo demostró el conejo # 4, se necesitaron 7 sesiones de entrenamiento antes de seguir el palo objetivo en la arena de entrenamiento, pero aprendió los siguientes comportamientos de objetivo rápidamente (es decir, dentro de 1-3 sesiones de entrenamiento). Este conejo #4 pareció ganarse la confianza del entrenador durante la introducción del objetivo, lo que facilitó el entrenamiento de los otros comportamientos objetivo. Sin embargo, este conejo todavía carecía de confianza en otras personas y no estaba dispuesto a mostrar la mayoría de los comportamientos objetivo en las sesiones de generalización.

Debe tenerse en cuenta que el objetivo no se definió como punto final en algunas secciones del protocolo. En cambio, por ejemplo, los animales tenían que seguir el objetivo durante un número variable de saltos o permanecer en la báscula durante un número variable de segundos. Se eligió un patrón de recompensa variable para aumentar y mantener la atención y motivación de los conejos en el entrenamiento.

Señales

Después de que los conejos hubieran realizado con éxito el paso 5.1, en todas las sesiones de entrenamiento siguientes, el entrenador colocó el objetivo a una distancia cercana a la nariz del conejo para indicarle que la prueba de entrenamiento comenzaba. Si el conejo tocaba el objetivo con la nariz o la boca, se consideraba la voluntad de participar en el entrenamiento y comenzaba el entrenamiento.

Los protocolos actuales no incluían ninguna otra señal, por ejemplo, la báscula, la caja de transporte o la mano no se consideraban señales. En su lugar, el objetivo se utilizaba para llevar al animal a la arena de entrenamiento, a la báscula, a la caja de transporte, al aire (cría) o al regazo del entrenador. Esto significa que los comportamientos de la meta "pesar", "entrar en la caja de transporte", "levantarse" y "saltar en el regazo" eran modificaciones de "seguir el objetivo". La razón de esto fueron los requisitos para el protocolo de entrenamiento: debía ser factible para ser realizado por el personal de los animalarios, que puede no ser experto en el entrenamiento de animales, y fácilmente integrable en la rutina diaria de trabajo. Por lo tanto, los protocolos deben ser eficientes y lograr los comportamientos objetivo rápidamente.

Sin embargo, la mano que se coloca delante del conejo (paso 8.3), la báscula o la caja de transporte también tienen el potencial de convertirse tanto en una señal como en un objetivo para las patas. Por lo tanto, puede ser posible definir pasos adicionales que vayan más allá de los protocolos actuales y no requieran el uso del palo de destino. Por ejemplo, tan pronto como el conejo ve la escala, la escala les indica a los conejos que salten sobre ella con las cuatro patas.

Adaptaciones de los protocolos

Aunque se puede esperar que el fenotipo de los animales de laboratorio casi genéticamente idénticos sea muy similar, existen "diferencias de comportamiento entre los individuos que son consistentes a lo largo del tiempo y en todas las situaciones [y] se denominan personalidad"⁵⁵, por ejemplo, algunos animales son bastante tímidos y otros^audaces56. Los animales tímidos y menos exploradores pueden tardar más en aprender los comportamientos objetivo definidos en el protocolo (por ejemplo, conejo #4). Aunque los protocolos de adiestramiento estándar puedan ser adecuados para la mayoría, el adiestramiento debe tener en cuenta las necesidades de cada animal y adaptarse a ellas, cuando sea necesario²⁶. Por lo tanto, se deben definir pasos intermedios adicionales más pequeños para aquellos conejos que no logren aprender un paso de entrenamiento del protocolo. Las etapas intermedias adicionales de capacitación deberían ayudarles a avanzar con éxito hacia la siguiente etapa. Especialmente debido a que los planes de entrenamiento se desarrollan en teoría y luego se prueban en la práctica, puede resultar evidente que se requieren pasos de entrenamiento adicionales para entrenar un comportamiento objetivo en particular.

Con respecto a los protocolos de entrenamiento actuales, se tuvieron que agregar algunos pasos de entrenamiento intermedios para los comportamientos objetivo "seguir el objetivo", "entrar en la caja de transporte", "criar" y "saltar en el regazo", como se describe en detalle en la sección sobre los resultados representativos, ya que los animales individuales no continuaron con el siguiente paso de entrenamiento. Curiosamente, la mayoría de los conejos requerían los pasos intermedios 8.2+ y 9.3+, lo que enfatiza su importancia. Por lo tanto, estos pasos se agregaron como una nota a los protocolos de capacitación.

Alternativamente, al paso definido 8.2+, el entrenador podría colocar una mano en el suelo con la palma hacia arriba y dejar que el conejo pise la mano con una y eventualmente ambas patas delanteras. Además, es concebible que un conejo requiera pasos intermedios adicionales antes del paso 9.3+, por ejemplo, primero el conejo coloca una pata trasera y luego ambas patas traseras en el regazo del entrenador. Si un conejo no acepta ser tocado en los pasos 9.5-9.9, la duración del contacto con las diferentes partes del cuerpo podría aumentarse gradualmente. Además, inicialmente solo se podían usar los dedos índice y medio para acariciar a los animales con una presión ligera como una pluma. Luego, el número de dedos utilizados para tocar y la presión se pueden aumentar en varios pasos.

Perfeccionamiento de las técnicas de manipulación

Se puede suponer que el manejo es altamente aversivo, especialmente en conejos con un rasgo de personalidad tímido. Los conejos son animales de presa terrestres y es probable que el hecho de ser levantados (es decir, levantados del suelo) o restringidos (es decir, sostenidos en los brazos de un humano) para una inspección de salud y un procedimiento experimental causen ansiedad y angustia. En los protocolos de entrenamiento se introdujo una opción para refinar los métodos de manejo: en lugar de sujetar al conejo por el pescuezo y levantarlo sobre el otro brazo, el conejo puede ser conducido con el palo de diana a la caja y llevado en la caja a la mesa de examen, como se sugirió anteriormente^{50. 57}, donde el conejo se transfiere suavemente de la caja a la mesa. Alternativamente, se puede quitar la parte superior de la caja, o se puede guiar al conejo con el palo de objetivo fuera de la caja.

Las observaciones conductuales realizadas después de que los conejos fueron recogidos utilizando la técnica de manejo convencional o la caja de transporte revelaron que la técnica de manejo convencional se asoció con un comportamiento más relacionado con el estrés y la ansiedad que la técnica alternativa. Esta conclusión se extrajo del alto número de animales que rechazaban la recompensa de comida en la mesa de examen y del mayor tiempo que pasaban escondidos en los refugios cuando se aplicaba la técnica de manipulación convencional. Curiosamente, la técnica de manejo no afectó el tiempo de interacción con el entrenador, lo que indica que el proceso de manejo puede no haber afectado la relación humano-animal. Sin embargo, además del entrenador, la caja de transporte también servía como "dispositivo de manipulación" (es decir, el dispositivo de manipulación de la técnica convencional era el entrenador, los dispositivos de manipulación de la técnica alternativa eran tanto el entrenador como la caja de transporte). Por lo tanto, también se analizó el tiempo de interacción con la caja de transporte. Aunque los conejos acababan de ser recogidos con la caja de transporte, pasaban más tiempo interactuando con la caja o dentro de la caja que cuando eran recogidos por la técnica convencional. Esto sugería que la caja de transporte podría estar asociada con un efecto positivo. Al comparar el tiempo dedicado a interactuar con ambos "dispositivos de manipulación" (es decir, la suma del tiempo dedicado a interactuar con la caja y el entrenador), la técnica de manipulación de la caja aumentó el tiempo de interacción con los "dispositivos de manipulación", es decir, esta técnica tuvo un claro efecto positivo en la respuesta conductual de los conejos hacia los "dispositivos de manipulación" en previsión de ser manipulados. Hallazgos similares se realizaron en ratones de laboratorio, demostrando que las técnicas de manejo suave y el entrenamiento redujeron el estrés y la ansiedad: los animales que fueron recogidos usando un túnel o las manos ahuecadas pasaron más tiempo interactuando voluntariamente con el "dispositivo de manipulación" y mostraron menos comportamiento relacionado con la ansiedad^{que los ratones} con mango de cola. El entrenamiento pareció reforzar este efecto. Leidinger et al. demostraron que los ratones de manejo suave (túnel/taza) mostraron menos micción, defecación y vocalización cuando estaban sujetos por el pescuezo y menos comportamiento de flotación en la prueba del laberinto acuático de Morris cuando fueron entrenados con PRT en comparación con los ratones no entrenados¹³.

Viabilidad de los protocolos para el trabajo diario: duración de la formación, retención y generalización.

El número de sesiones de entrenamiento necesarias para aprender un comportamiento objetivo dependía del animal individual y de los comportamientos objetivo, que comprendían un número diferente de pasos que iban desde la sección 3 hasta la sección 9 del protocolo presentado anteriormente.

De acuerdo con el número de animales que lograron aprender un comportamiento objetivo y el número de adaptaciones que se tuvieron que hacer a los protocolos para los animales individuales, los pasos de entrenamiento tuvieron diferentes niveles de dificultad. El comportamiento de "seguir al objetivo" fue la primera experiencia de entrenamiento de los conejos y, por lo tanto, a algunos animales les tomó más tiempo entrenarse en este comportamiento que en el otro comportamiento objetivo, como se discutió anteriormente. Si bien todos los animales podían ser entrenados en el "pesaje" de acuerdo con el protocolo actual, se requerían medidas provisionales adicionales para "entrar en la caja de transporte" por dos animales y para la "cría", así como para "saltar en el regazo" por casi todos los conejos. Esto puede explicarse por el grado de contacto físico entre el animal y el entrenador que fue necesario para realizar las diferentes conductas objetivo. El "pesaje" y la "entrada en la caja de transporte" no implicaban ningún contacto físico entre el animal y el ser humano. El paso final de la "cría" (8.3) y los pasos 9.2-9.4 de "saltar en el regazo" requerían que los conejos hicieran contacto físico con el entrenador. Además, el entrenador tocó el hombro, la espalda, la grupa, las orejas o las patas del conejo en los pasos 9.5-9.9 de "salto en el regazo", aumentando el grado de contacto físico entre el animal y el entrenador. Aceptar que los tocaran fue más difícil para algunos conejos que para otros. Como se ha comentado anteriormente, fue beneficioso adaptar los protocolos de entrenamiento de estas conductas objetivo y añadir pasos intermedios.

Sin embargo, tres conejos requirieron sesiones de entrenamiento adicionales para completar el comportamiento objetivo "saltar en el regazo" (# 4, # 7, # 10). Se podían excluir las deficiencias físicas que impedían a estos animales saltar sobre el regazo del entrenador. Además, los conejos podían saltar a sus casas, las alturas de estas eran más altas que el regazo del entrenador.

Se notó que dos de estos tres conejos (#4 y #10) necesitaron más tiempo para acostumbrarse al entrenador, así como a la recompensa de comida en las sesiones de habituación, y parcialmente necesitaron más sesiones de entrenamiento para alcanzar el paso final de otros comportamientos objetivo. Esto también fue cierto para el conejo #7, que tuvo una lesión en la cola debido a peleas dentro del grupo desde la cuarta sesión de habituación. Por lo tanto, el conejo # 7 fue recogido, transferido a la mesa de examen, tratado e inspeccionado diariamente durante 15 días, lo que puede haber resultado en una mayor precaución hacia los humanos. Por un lado, es crucial tener en cuenta que el rendimiento del entrenamiento puede verse afectado, por ejemplo, por un estado de salud deteriorado, un aumento de los niveles de estrés o una relación humano-animal perturbada debido a otras intervenciones. Por otro lado, estas observaciones demostraron la importancia de la habituación para el entrenador y la recompensa de la comida. Algunos animales pueden necesitar más tiempo para familiarizarse con la presencia del entrenador y aceptar la recompensa de comida del entrenador. Si se hubieran realizado sesiones de habituación adicionales, el conejo # 4 y # 10 podría haberse desempeñado mejor en las sesiones de entrenamiento. La relevancia de habituar a los conejos para los humanos ya ha sido reportada en la literatura. El criador comercial, al que se compraron los conejos utilizados en este estudio, introdujo recientemente sesiones regulares de caricias, lo que redujo el comportamiento relacionado con el estrés y eliminó las agresiones⁵⁸. En un estudio anterior, se demostró que las caricias y el manejo de conejos jóvenes disminuyen el comportamiento relacionado con la ansiedad, aumentan su aumento de peso y reducen la tasa de mortalidad⁵⁹.

Una vez que los conejos habían aprendido los diferentes comportamientos objetivo, aún podían mostrarlos después de dos descansos de entrenamiento cortos (una semana) y largos (aproximadamente 7,5-9,5 semanas), excepto con excepciones individuales. Estas observaciones pueden indicar que es suficiente pedir a los conejos que realicen los comportamientos de gol entrenados una vez a la semana cuando se realiza el examen general y se limpia la habitación/corral.

Para la viabilidad del protocolo para la vida laboral diaria, también es crucial que los conejos generalicen los comportamientos objetivo entrenados a otras personas que no sean el entrenador. En caso de vacaciones o enfermedad, otra persona tiene que continuar con el entrenamiento y cuidado de los animales. La mayoría de los conejos (doce de trece) generalizaron las conductas objetivo "pesar", "entrar en la caja de transporte" y "criar" al cuidador del animal, aunque, en algunos casos, los conejos necesitaron más de una sesión de entrenamiento para mostrar el comportamiento deseado. "Pesar" parecía generalizarse mejor; seguido de "introducción de la caja de transporte" y "cría". Sin embargo, "saltar en el regazo" parecía ser más difícil de generalizar a otra persona. Los animales tardaron más en demostrar el comportamiento deseado (9.9.) y dos conejos, que previamente habían aprendido el paso final 9.9, no lograron mostrar este comportamiento objetivo, posiblemente debido al mayor contacto físico necesario (ver arriba). Un conejo (#4) no mostró ningún paso de los comportamientos objetivo "pesar", "entrar en la caja de transporte" y "criar" y no estaba interesado en interactuar con el cuidador del animal. El conejo #4 fue uno de los animales que necesitó más tiempo para acostumbrarse al adiestrador y a la recompensa de comida en las sesiones de habituación. Esto puede indicar que, para algunos individuos, las sesiones adicionales en las que los cuidadores de los animales pasan tiempo con los conejos, los habitúan a aceptar la recompensa de la comida de ellos y construyen un vínculo positivo son beneficiosas²³. Los conejos pueden ser capaces de distinguir entre diferentes personas, como se ha demostrado en el caso de las ratas⁶⁰. Otros factores que tienen el potencial de afectar el rendimiento de los conejos en las sesiones con el entrenador y el cuidador del animal pueden ser señales inconscientes que el entrenador dio a los animales durante las sesiones de entrenamiento, por ejemplo, la posición del palo objetivo o el tazón de recompensa, la posición del cuerpo o el movimiento. Si el entrenador no está consciente de estas señales, no se documentarán y las otras personas no imitarán estas señales.

Además, las habilidades de entrenamiento de las personas que trabajan con los animales, incluida la rutina de manejo del palo de tiro y la presentación de recompensas, pueden influir en el comportamiento de los animales. Además del conocimiento de los principios de aprendizaje y la comunicación animal, se necesitan experiencias prácticas para entrenar con éxito a un animal^y recuperar un comportamiento objetivo. Dado que no se compararon las sesiones de generalización en las que participaba una persona cualificada y una no cualificada, no se puede determinar la pertinencia del factor "habilidades de formación". Sin embargo, según el conocimiento de los autores, una gran proporción del personal de animales de laboratorio no está capacitado en el entrenamiento de animales y, por lo tanto, las condiciones en las que se realizaron las sesiones de generalización (es decir, involucrar a un cuidador de animales con poca experiencia previa en el entrenamiento de clicker) representaban un entorno realista en las instalaciones de animales de laboratorio.

Los datos representativos de los protocolos proporcionan a los animalarios una idea de la carga de trabajo asociada al entrenamiento de las diferentes conductas objetivo. Los datos pueden ayudar a los animalarios a crear sus propios horarios de trabajo al implementar (partes de) el protocolo. Dependiendo del animal individual y de los comportamientos objetivo, se debe reservar un tiempo adicional para el proceso de generalización. Sin embargo, la duración del tiempo puede variar cuando se trabaja con conejos machos u otra raza de conejo. En las instalaciones para animales, se debe mantener una discusión sobre si existe el tiempo adecuado y qué debe cambiarse para permitir tiempo para el entrenamiento de los animales.

Además del tiempo necesario para el adiestramiento de los animales, hay que tener en cuenta que la formación requiere formadores cualificados y enseñar al personal a adiestrar a los animales también puede llevar mucho tiempo. Si la capacitación fuera una parte obligatoria de la educación del personal de animales de laboratorio, es decir, cuidadores de animales, veterinarios e investigadores, la implementación de la capacitación de animales en las instalaciones se facilitaría y tomaría menos tiempo. Según el anexo III de la Directiva 2010/63/UE, "los establecimientos establecerán programas de habituación y formación adecuados a los animales, los procedimientos y la duración del proyecto", es decir, el adiestramiento de los animales es obligatorio por ley. En Alemania, estos programas deben presentarse al solicitar una licencia de experimentación con animales. Esto requiere que las personas que planifican experimentos con animales y trabajan con animales de laboratorio estén capacitadas en el entrenamiento de animales. Sin embargo, al menos en Alemania, el adiestramiento de animales no forma parte del programa de formación de los cuidadores de animales en el campo de la investigación y la clínica 62,63,64. Además, no se menciona explícitamente en las recomendaciones de la UE para el marco de educación y formación⁶⁵. Por lo tanto, mientras la formación no se haya implementado en estas normas, el desarrollo profesional continuo centrado en la formación en refuerzo positivo necesita más atención. El personal de los animales de laboratorio necesita aprender los principios de las técnicas de aprendizaje y entrenamiento, los criterios necesarios, la transferencia de procedimientos entre los entrenadores, el mantenimiento de registros y cómo responder a los animales que no participan de la manera deseada para garantizar la coherencia y la previsibilidad.

Interacción humano-animal

El tiempo intensivo de interacción humano-animal durante las sesiones de entrenamiento proporciona un entorno óptimo para fortalecer la relación entre los conejos individuales y el entrenador^26,66. Una relación positiva entre el ser humano y el animal es beneficiosa para el bienestar de los animales, ya que puede reducir sus niveles de estrés en la cría y en entornos experimentales⁶⁷. En los protocolos de entrenamiento presentes, el entrenador considera la agencia de los conejos y pueden decidir participar (o no participar) en el entrenamiento de forma voluntaria. Proporcionar a los animales agencia es beneficioso para su bienestar ¹⁶ y, por lo tanto, debe perseguirse en los experimentos, así como en el alojamiento y la cría. Existen diferentes niveles de agencia conductual⁶⁸; la participación en el PRT puede atribuirse al nivel de agencia impulsado por la acción, es decir, "comportarse activamente para lograr los resultados actuales [por ejemplo, procurar alimentos]"⁶⁸.

Al analizar el acercamiento voluntario de los conejos hacia el entrenador y una persona desconocida, se pudo observar una intensa interacción humano-animal. Los resultados revelaron que todos los conejos, excepto un animal en el^{primer ensayo (} #12), interactuaron tanto con el entrenador como con la persona desconocida. Parecían reconocer al entrenador ya que mostraron una clara preferencia por interactuar con el entrenador en la^1ª prueba y algunos de ellos saltaron con las cuatro patas en el regazo del entrenador; Un comportamiento que no se mostró hacia la persona desconocida. Aunque los conejos pasaron más tiempo interactuando con el entrenador que con la persona desconocida en la^1ª prueba, el tiempo de interacción ya no difirió en la^2ª prueba. Una razón para esta observación puede ser que los conejos esperaban recibir una recompensa de comida del entrenador en el^{primer ensayo y} , debido a la falta de recompensas de comida en la prueba de enfoque voluntario, ya no pasaron más tiempo con el entrenador en el^{segundo ensayo.} Sin embargo, estos datos enfatizaron que los conejos entrenados se habituaron rápidamente a la presencia de una persona desconocida y ninguno de ellos era demasiado tímido para interactuar. Por el contrario, eran muy exploradores e interesados en la persona desconocida. Sin embargo, dado que no se investigó un grupo de control no entrenado, el efecto del entrenamiento en el comportamiento de acercamiento voluntario de los conejos no está claro.

Una hipótesis que explica el comportamiento del conejo #12 en el 1er^{ensayo es} que este individuo todavía tenía que habituarse a la presencia de la persona desconocida en el^{primer ensayo y} estaba más interesado en interactuar tanto con el entrenador (70 segundos) como con la persona desconocida (9 segundos) en el^{segundo ensayo.} Los conejos tienen diferentes rasgos de personalidad que pueden afectar el nivel de comodidad alrededor de personas desconocidas y, a su vez, la latencia para acercarse o la duración del tiempo de interacción con una persona^69,70.

Limitaciones

Somos conscientes de que todos los conejos en el corral/habitación, no solo el que participa en el entrenamiento, pueden escuchar el clic (es decir, el reforzador condicionado) durante una sesión de entrenamiento y su efecto reforzante puede debilitarse ya que la recompensa de la comida (es decir, el reforzador natural/incondicionado) no se presenta. Si un conejo fuera de la arena de entrenamiento muestra un comportamiento entrenado y escucha el clic, pero no se le presenta comida (y este escenario ocurre varias veces), el comportamiento entrenado puede extinguirse. Este fenómeno se conoce como extinción^64,71. Sin embargo, dado que todos los comportamientos de los objetivos de los protocolos presentes dependen del objetivo presentado por el entrenador, es poco probable que ocurra la extinción en nuestro entorno de entrenamiento.

Dado que las paredes del campo de entrenamiento eran transparentes y el campo de entrenamiento estaba ubicado en el corral, los conejos podían verse, escucharse y olerse entre sí durante el entrenamiento, lo cual es una clara ventaja relacionada con el bienestar. Además, es posible que los conejos hayan observado a los miembros de su grupo durante las sesiones de entrenamiento y hayan aprendido unos de otros. En ratas, se demostró previamente que los individuos aprendieron a realizar un comportamiento objetivo al observar a su compañero de jaula siendo entrenado por PRT⁴⁵. Este hecho puede considerarse tanto como una ventaja como una desventaja. El progreso del aprendizaje de los animales puede ser más rápido cuando pueden observarse unos a otros. Sin embargo, los datos de los animales individuales pueden verse influidos por el rendimiento de los miembros del grupo y no pueden atribuirse únicamente al entrenamiento del animal individual. Por lo tanto, el entrenamiento de animales sin ningún contacto con los miembros de su grupo o conejos de un solo hogar podría llevar más tiempo.

Las observaciones conductuales de los individuos (en la prueba de enfoque voluntario y después de aplicar las diferentes técnicas de manejo) se llevaron a cabo en su entorno social y grupal familiar para evitar el estrés y la distracción causados por un entorno novedoso y la separación de su grupo, lo que a su vez habría afectado las observaciones conductuales. La desventaja es, sin embargo, que los conejos pueden haber influido en el comportamiento de los demás durante las sesiones de observación.

Los efectos de las técnicas de manejo solo se investigaron en siete animales involucrando al entrenador como persona que manejaba a los animales. Los autores planean un estudio de seguimiento que incluya un cálculo del tamaño de la muestra a priori para reproducir los hallazgos con otros manipuladores y examinar más a fondo las diferencias entre las técnicas de manipulación.

Todos los seres humanos involucrados en el entrenamiento, el manejo y la prueba de enfoque voluntario eran mujeres. No se investigó si el rendimiento del entrenamiento de los conejos o su comportamiento variarían si hubiera personas de sexo masculino involucradas.

Los protocolos de entrenamiento actuales deben dar al lector una idea de lo que se puede entrenar en conejos, pero no comprenden todos los posibles comportamientos objetivo que sería beneficioso entrenar en un conejo de laboratorio. Por ejemplo, marcar un conejo como se sugiere en la sección de protocolo sobre requisitos generales también valdría la pena entrenarlo usando PRT.

Como se señaló más arriba, la elección de la recompensa correcta no es trivial. Debido a las restricciones de higiene, el uso de hierbas frescas como recompensa alimentaria no está permitido en algunas instalaciones de animales de laboratorio y, por lo tanto, se deben usar recompensas alimentarias menos apropiadas, como semillas de girasol o golosinas de forrajeo a base de granos. Con respecto a la decisión sobre la recompensa alimentaria, algunas reglas y regulaciones de las prácticas actuales de laboratorio son perjudiciales para el bienestar de los animales y el entrenamiento efectivo y, por lo tanto, puede que deban reconsiderarse caso por caso. También puede ser posible utilizar alternativas a las recompensas de comida, por ejemplo, toques suaves o interacciones con el entrenador o elementos de enriquecimiento. Sin embargo, el entrenador debe asegurarse para cada animal individual de que la alternativa es recompensar al animal porque una recompensa solo es una recompensa si el conejo realmente lo favorece. Especialmente, las caricias pueden no ser recibidas como gratificantes por todos los conejos.

Conclusiones

En resumen, el presente estudio fue un primer paso para llenar el vacío de conocimiento sobre los protocolos de entrenamiento adecuados para conejos de laboratorio. Las hembras de conejo blanco de Nueva Zelanda podrían ser entrenadas para los procedimientos de cría de rutina utilizando PRT y generalizar los comportamientos objetivo aprendidos a otras personas, aunque se debe reservar tiempo adicional para el proceso de generalización. Las conductas de meta sin contacto físico parecían ser más fáciles de aprender que las conductas que requerían contacto físico con los humanos. Después de que los animales completaron con éxito el entrenamiento de un comportamiento objetivo, fue suficiente recuperarlos una vez a la semana en el contexto del examen general y la limpieza del corral. Los protocolos de adiestramiento que se consideran de aplicación general a todos los conejos son convenientes, pero el adiestrador debe ser consciente de que, en algunos casos, debe adaptarse a las necesidades del animal. Los resultados sobre las técnicas de manejo sugirieron que recoger a los conejos con la caja de transporte en lugar de sujetarlos por el pescuezo y levantarlos sobre el brazo era menos aversivo. Con todo, los protocolos actuales proporcionan instrucciones factibles para el proceso de habituación y entrenamiento de los conejos y pueden servir como refinamiento en las instalaciones de animales de laboratorio.

Los animales no deben sufrir debido al ahorro de trabajo, tiempo o dinero (al menos según la Ley Alemana de Bienestar Animal⁷²). Es importante cuidar y manipular a todos los animales de la manera más suave posible. Dado que los animales no entrenados sufren en mayor grado de ansiedad y angustia causadas por los procedimientos experimentales y rutinarios de cría que sus contrapartes entrenadas¹³, el entrenamiento es una simple medida de refinamiento para prevenir eficazmente que experimenten estados afectivos negativos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bed-r’Nest	The Andersons, Inc., Maumee, USA		The successful implementation of the protocol does not depend on this particular product. You could use comparable products by other companies.
Finger Clicker	ASCO		https://ascoshop.de/products/fingerclicker
G*Power		version 3.1.9.7
Heu-Proppen	Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Germany		The successful implementation of the protocol does not depend on this particular product. You could use comparable products by other companies.
IBM Corp. Released 2020. IBM SPSS Statistics for Windows,  Armonk, NY: IBM Corp	IBM Corp	Version 27.0.	in the manuscript referred to as "software for advanced statistical analysis"
Kaninchen Haltung + 25 mg/kg Salinomycin-Natrium-Sondermischung	Ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Germany		The successful implementation of the protocol does not depend on this particular product. You could use comparable products by other companies.
Lignocel block	Lignocel J. Rettenmaier &Söhne GmbH + Co KG, Rosenberg, Germany		The successful implementation of the protocol does not depend on this particular product. You could use comparable products by other companies.
Lillebro geschälte Sonnenblumenkerne”, Martina GmbH, München, Germany) and Rainbow Foraging Bits (Bio-Serv, Flemington, USA)	Martina GmbH, München, Germany		The successful implementation of the protocol does not depend on this particular product. You could use comparable products by other companies.
Microsoft Excel for Microsoft 365 MSO	Microsoft Corporation	Version 2305	in the manuscript referred to as "spread sheet"
New Zealand White rabbits	Charles River Laboratories France
Plattformwaage DE 35K5DL	KERN & SOHN GmbH, Balingen-Frommern, Germany		The successful implementation of the protocol does not depend on this particular product. You could use comparable products by other companies.
Premium scientific bedding (fine & flake)	SAFE, Augy, France		The successful implementation of the protocol does not depend on this particular product. You could use comparable products by other companies.
Rainbow Foraging Bits	Bio-Serv, Flemington, USA		The successful implementation of the protocol does not depend on this particular product. You could use comparable products by other companies.
Snackball für Kaninchen – 7 cm	TRIXIE Heimtierbedarf GmbH & Co. KG, Tarp, Germany		The successful implementation of the protocol does not depend on this particular product. You could use comparable products by other companies.
Target stick with integrated clicker	TRIXIE Heimtierbedarf GmbH & Co. KG, Tarp, Germany		The successful implementation of the protocol does not depend on this particular product. You could use comparable products by other companies.
Trixi Transportbox Capri Open Top	TRIXIE Heimtierbedarf GmbH & Co. KG, Tarp, Germany		The successful implementation of the protocol does not depend on this particular product. You could use comparable products by other companies.
Weiden-Heuball	JR FARM GmbH, Holzheim-Pessenburgheim, Germany		The successful implementation of the protocol does not depend on this particular product. You could use comparable products by other companies.