Uso de imágenes en vivo ex vivo para investigar las divisiones celulares y los movimientos durante la renovación dental del ratón

Resumen

La imagen en vivo ex vivo es una técnica poderosa para estudiar los procesos dinámicos de los movimientos e interacciones celulares en los tejidos vivos. Aquí, presentamos un protocolo que implementa la microscopía de dos fotones para rastrear en vivo las células epiteliales dentales en incisivos de ratones adultos enteros cultivados.

Resumen

El incisivo de ratón en continuo crecimiento está emergiendo como un sistema modelo altamente manejable para investigar la regulación de las células madre epiteliales y mesenquimales adultas y la regeneración dental. Estas poblaciones progenitoras se dividen, se mueven y se diferencian activamente para mantener la homeostasis tisular y regenerar las células perdidas de manera receptiva. Sin embargo, los análisis tradicionales que utilizan secciones fijas de tejido no pudieron capturar los procesos dinámicos de los movimientos e interacciones celulares, lo que limitó nuestra capacidad para estudiar sus regulaciones. En este trabajo se describe un protocolo para mantener incisivos enteros de ratón en un sistema de cultivo de explantes y células epiteliales dentales de seguimiento vivo mediante microscopía de lapso de tiempo multifotónica. Esta técnica se suma a nuestra caja de herramientas existente para la investigación dental y permite a los investigadores adquirir información espacio-temporal sobre el comportamiento y las organizaciones celulares en un tejido vivo. Anticipamos que esta metodología ayudará a los investigadores a explorar más a fondo los mecanismos que controlan los procesos celulares dinámicos que tienen lugar tanto durante la renovación como durante la regeneración dental.

Introducción

En las últimas dos décadas, el incisivo de ratón se ha convertido en una plataforma inestimable para investigar los principios de la regulación de las células madre adultas y la regeneración dental ^1,2. El incisivo del ratón crece continuamente y se renueva a lo largo de la vida del animal. Lo hace mediante el mantenimiento de células madre epiteliales y mesenquimales, que pueden autorrenovarse y diferenciarse en diferentes tipos de células del diente ^1,2. Mientras que las células madre epiteliales dentales dan lugar a los ameloblastos, que secretan la matriz del esmalte, las células madre mesenquimales dentales dan lugar a odontoblastos, cementoblastos y fibroblastos, que forman la dentina, el cemento y el ligamento periodontal, respectivamente 3,4,5,6. Este suministro constante de nuevas células mantiene la homeostasis tisular y permite la reposición de células viejas que se pierden debido al desgaste masticatorio o a las lesiones ^7,8. Por lo tanto, dilucidar los mecanismos celulares y moleculares que regulan el mantenimiento y la diferenciación de las células madre dentales es fundamental para comprender la regeneración dental, un área de creciente interés.

Anatómicamente, una gran parte del incisivo del ratón adulto está encerrada en la mandíbula. Mientras el borde incisal del diente está expuesto, el extremo apical del incisivo encaja dentro de un alvéolo y está firmemente unido al hueso circundante a través de los ligamentos periodontales y los tejidos conectivos (Figura 1A, B). El extremo apical del incisivo es también la región de crecimiento del diente y mantiene las células madre y progenitoras dentales tanto en la capa epitelial como en la pulpa mesenquimal 9,10,11,12,13. Específicamente, las células madre epiteliales dentales se mantienen en el extremo bulboso del epitelio, conocido como yema apical, también conocida como asa cervical labial (Figura 1C). Al igual que el epitelio intestinal y la epidermis, la renovación epitelial en el incisivo se apoya principalmente en el ciclo activo de las células madre y sus descendientes intermedios altamente proliferativos, llamados células amplificadoras de tránsito 14,15,16,17, ambas residiendo en la parte interna del asa cervical. Sin embargo, aún no se ha determinado si el epitelio incisivo contiene y utiliza células madre quiescentes durante la regeneración. Por el contrario, se han identificado células madre mesenquimales dentales activas y quiescentes en la pulpa apical, y las células madre quiescentes funcionan como una población de reserva que se activa durante la reparación de la lesión^13,18.

Muchos de los descubrimientos sobre la biología de la renovación y regeneración de los incisivos del ratón han sido el resultado de investigaciones histológicas, en las que las muestras se obtienen en distintas coyunturas temporales, se fijan, se procesan y luego se seccionan en rodajas de una micra de espesor a lo largo de un plano particular. A través de un análisis detallado de secciones histológicas de diferentes modelos de ratón que permiten el rastreo de linajes o perturbaciones genéticas, los científicos han identificado los linajes celulares de diferentes poblaciones de progenitores, así como las vías genéticas y de señalización que controlan la homeostasis de los incisivos y la reparación de lesiones 19,20,21. Sin embargo, las imágenes estáticas bidimensionales (2D) de células no vitales en secciones no pueden capturar el espectro completo de comportamientos celulares y organizaciones espaciales en el tejido vivo, como los cambios en la forma de las células, los movimientos y la cinética celular. Detectar y medir estos cambios celulares rápidos, que ocurren en una escala de tiempo que no se puede resolver a través del corte de tejidos, requiere una estrategia diferente. Además, la adquisición de dicha información también es fundamental para comprender cómo las células dentales interactúan entre sí, reaccionan a diferentes estímulos de señalización y se autoorganizan para mantener las estructuras y funciones de los tejidos.

El advenimiento de la obtención de imágenes de tejidos profundos en cuatro dimensiones (4D) mediante microscopía de dos fotones²², una tecnología que integra tres dimensiones espaciales con resolución temporal, supera las limitaciones inherentes al análisis histológico al permitir el examen espaciotemporal de explantes de tejidos cultivados, organoides o incluso tejidos in situ 23,24,25,26 . Por ejemplo, las imágenes en vivo en 4D del epitelio dental en desarrollo han revelado los patrones espacio-temporales de las divisiones celulares y las migraciones que coordinan el crecimiento del tejido, la formación del centro de señalización y la morfogénesis epitelial dental 27,28,29,30,31,32. En el incisivo de ratón adulto, las imágenes 4D se han adaptado recientemente para estudiar los comportamientos celulares durante la reparación de lesiones epiteliales dentales. Las imágenes en vivo revelaron que las células del estrato intermedio en la capa suprabasal pueden convertirse directamente en ameloblastos en la capa basal para regenerar el epitelio dañado, desafiando el paradigma tradicional de reparación de lesiones epiteliales¹⁵.

Aquí, describimos la disección, el cultivo y la obtención de imágenes del incisivo de ratón adulto, centrándonos en las células epiteliales del asa cervical labial (Figura 1). Esta técnica preserva la vitalidad de las células dentales durante más de 12 h y permite el seguimiento en vivo de las células marcadas con fluorescencia a una resolución de una sola célula. Este enfoque permite investigar el movimiento y la migración celular, así como los cambios dinámicos en la forma celular y la orientación de la división en condiciones normales de cultivo, o en respuestas a perturbaciones genéticas, físicas y químicas.

Protocolo

Todos los ratones se mantuvieron en instalaciones de animales libres de patógenos en la Universidad de California en Los Ángeles (UCLA) o la Universidad Hebrea de Jerusalén (HUJI). Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con las normas y protocolos aprobados por el respectivo Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) (ARC-2019-013; UCLA) o (MD-23-17184-3; HUJI). En la Figura 2A se muestra un flujo de trabajo general de los pasos experimentales. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los instrumentos, reactivos y materiales utilizados en este protocolo.

1. Preparación de soluciones y geles

1. Medio de disección: Preparar DMEM/F12 fresco con glucosa al 0,5% y mantenerlo caliente a 37 °C hasta que lo necesite en el paso 2.4.
   NOTA: Utilizamos DMEM/F12 sin rojo de fenol para reducir la autofluorescencia durante la obtención de imágenes en vivo.
2. 1x Medio de cultivo: Prepare un medio fresco con 50% DMEM/F12, 50% de suero de rata, 1x sustituto de glutamina, 1x aminoácidos no esenciales MEM, 1% de glucosa, 0,1 mg/ml de ácido L-ascórbico y 0,5% de penicilina-estreptomicina. Manténgalo caliente a 37 °C hasta que lo necesite en el paso 5.5. Este medio se utiliza para el cultivo de explantes de incisivos durante la obtención de imágenes en vivo.
   NOTA: El suero de rata debe ser de alta calidad y estar especialmente preparado para el cultivo de tejidos enteros por parte de investigadores o de una fuente comercial. En particular, la sangre debe centrifugarse (durante 5 minutos a 1.200 × g a temperatura ambiente) antes de que comience a formarse la coagulación. Después de la centrifugación, el coágulo de fibrina resultante debe exprimirse y desecharse³³.
3. Gel de cultivo: El propósito del gel es inmovilizar las muestras durante la obtención de imágenes y se prepara fresco.
   1. Hacer gel al 2% en DMEM/F12 disolviendo 200 mg de agarosa de bajo punto de fusión en 10 mL de DMEM/F12 usando un microondas. Mantener el gel al 2% a 37 °C.
   2. Prepare 2 medios de cultivo (sin DMEM/F12) mezclando suero de rata al 50 %, 1 sustituto de glutamina, 1 aminoácido no esencial MEM, glucosa al 1 %, 0,1 mg/ml de ácido L-ascórbico y penicilina-estreptomicina al 0,5 %. Calentar el medio de cultivo 2x (sin DMEM/F12) a 37 °C.
   3. Haga gel de cultivo al 1% mezclando volúmenes iguales de gel al 2% y medio de cultivo 2x (sin DMEM/F12). Mantenga el gel de cultivo al 1% a 37 °C hasta que lo necesite en el paso 5.1.
      NOTA: Asegúrese de que todas las soluciones estén tibias antes de mezclarlas para evitar que se gelifiquen. Encontramos que el gel al 1% es adecuado para cultivar el incisivo de ratón adulto. El porcentaje de gel debe determinarse empíricamente si se van a cultivar otros tejidos.

2. Extracción de las mandíbulas de los ratones adultos

1. Sacrificar ratones a la edad deseada utilizando procedimientos estándar aprobados por la IACUC.
   NOTA: Aquí utilizamos asfixia por CO₂ seguida de luxación cervical. Las regulaciones para la eutanasia animal pueden variar en diferentes regiones. Los investigadores deben obtener la aprobación institucional necesaria antes de realizar experimentos y garantizar el cumplimiento de las regulaciones locales de cuidado de animales.
2. Desinfecte el ratón con etanol al 70%.
3. Decapita al ratón y extrae las mandíbulas izquierda y derecha.
   1. Coloque el mouse sobre su vientre, luego use una hoja de afeitar industrial de un solo filo # 9 para cortar en la región del cuello y separar la cabeza del mouse del resto del cuerpo.
      NOTA: Si también se van a recolectar tejidos de la faringe o de la región del cuello, no se debe realizar la decapitación, y se puede proceder directamente al paso 2.3.2.
   2. Dale la vuelta al ratón para que su lado ventral quede hacia arriba y las mandíbulas sean fácilmente accesibles.
   3. Asegure la cabeza del animal sosteniéndola suavemente entre el pulgar y el índice.
   4. Usa la hoja de afeitar para hacer una incisión sagital media que corte sobre la piel de la mandíbula inferior desde el labio inferior hacia el escote.
      NOTA: También se puede usar una cuchilla quirúrgica # 15 para realizar la incisión y las disecciones posteriores (pasos 2.3.6-2.3.9).
   5. A medida que se realiza la incisión, extienda la piel cortada con el pulgar y el índice para exponer los músculos y la mandíbula debajo.
   6. Use la hoja de afeitar para cortar los músculos maseteros en el lado bucal de la mandíbula inferior, de modo que el exterior de los hemimandibles izquierdo y derecho ahora esté libre de inserciones musculares.
   7. Separe los músculos milohioideos a lo largo del lado interno de la mandíbula para eliminar las inserciones musculares allí.
   8. Haga otra incisión en la sínfisis mandibular que conecta los dos hemimandibles. Una vez cortada, la mandíbula se separará en las mitades izquierda y derecha.
   9. Coloque la hoja de afeitar entre el cóndilo mandibular y la articulación mandibular temporal y diseccione cuidadosamente el hemimandible del resto de la cabeza.
      NOTA: Nos resultó útil tirar suavemente del incisivo al mismo tiempo mientras se corta. Se debe tener cuidado para evitar romper la mandíbula y dañar los tejidos blandos del interior.
4. Transfiera inmediatamente las mandíbulas disecadas a una placa de Petri con el medio de disección precalentado (paso 1.1) y retire los tejidos musculares restantes con una cuchilla quirúrgica # 15.
   NOTA: Mantener las muestras en medios fríos ralentiza las actividades celulares, lo que resulta en recuperaciones retrasadas o incluso fallidas de ciertas actividades celulares, como la proliferación o el movimiento celular, durante la obtención de imágenes en vivo.

3. Aislamiento de todos los incisivos del ratón

NOTA: El aislamiento adicional del incisivo se realiza bajo un microscopio de disección de campo claro.

1. Identificar visualmente la región ovalada de la mandíbula que cubre la cavidad del incisivo y alberga la porción apical del incisivo.
2. Coloque la mandíbula de modo que la superficie interna (lingual) quede hacia arriba.
3. Mientras sostiene la mandíbula en su lugar con un par de pinzas dentadas, genere una ventana en la región ovalada afeitando el hueso de la membrana suprayacente con una cuchilla quirúrgica # 15, en una dirección que sea desde el cóndilo hacia los molares. Esto expone el tejido blando del incisivo apical en la superficie interna.
4. Dé la vuelta a la mandíbula de modo que la superficie externa (bucal) quede hacia arriba.
5. Genere una ventana en la región ovalada de la mandíbula externa como se describe en el paso 3.3 y utilice la punta del bisturí para recoger los fragmentos óseos restantes en el borde. Asegúrese de que el extremo apical del diente sea visible desde ambos lados.
   NOTA: Evite la presión excesiva mientras afeita los huesos para evitar daños en los tejidos blandos subyacentes.
6. Cortar sistemáticamente los huesos que rodean el incisivo para aislar todo el diente.
   1. Haga un corte limpio en un plano que esté inmediatamente adyacente al incisivo apical para eliminar primero la apófisis condilar.
      NOTA: Tenga cuidado de no cortar el incisivo.
   2. Hacer un segundo corte justo posterior al 3er molar, pero dorsal al incisivo sin dañar el diente. Esto elimina el hueso que incluye la apófisis coronoides.
   3. Cortar en serie desde la punta de la apófisis angular hacia el incisivo para eliminar gradualmente la mandíbula ventral de manera escalonada.
      NOTA: El epitelio dental y los tejidos periodontales asociados a menudo se adhieren al hueso y se arrancan fácilmente si se corta una gran parte del hueso ventral de una sola vez. Para separar el hueso del tejido blando del incisivo, se puede insertar el bisturí (o un par de pinzas afiladas no dentadas) entre los dos tejidos en el extremo apical del incisivo y deslizar delicadamente el instrumento hacia adelante.
   4. Corta el hueso alveolar con los molares y cualquier hueso restante que aún esté unido al incisivo.
   5. Ahora se aísla todo el incisivo. Transfiera el incisivo completamente diseccionado a una placa con medios de disección limpios y tibios (paso 1.1).
7. Repita los pasos 3.2-3.6 para aislar los incisivos adicionales según sea necesario.
   NOTA: Los incisivos maxilares/superiores del ratón también mantienen células madre adultas y pueden utilizarse para estudiar la regeneración dental³⁴. Los investigadores dentales suelen centrarse en los incisivos inferiores porque son más accesibles y se pueden diseccionar más fácilmente que los incisivos superiores. Las diferencias entre las células progenitoras de los incisivos mandibulares y maxilares aún no se han determinado.

4. Extirpación de tejidos periodontales para exponer el asa cervical epitelial incisivo

1. Con todo el incisivo acostado sobre su lado lingual y mientras sostiene el diente en su lugar con un par de pinzas dentadas, use un par de pinzas finas # 5 para comenzar a meter los tejidos periodontales que cubren el incisivo apical y la región del asa cervical.
2. Retire con cuidado el tejido periodontal de la yema apical, de modo que el lado lateral del asa cervical (u otras regiones de interés) se haga visible debajo del endoscopio.
   NOTA: Se debe tener cuidado para evitar dañar el epitelio dental o desprenderlo del mesénquima. Si el incisivo tiene señales de fluorescencia en la región de interés y se dispone de un microscopio de disección fluorescente, se pueden utilizar señales de fluorescencia para ayudar a distinguir entre los tipos de tejido y ayudar a las disecciones. Es importante llevar a cabo eficientemente las secciones 2-4 para que las muestras puedan transferirse rápidamente a los medios de cultivo y mantenerse adecuadamente mediante el cultivo de explantes (véase más adelante).

5. Inclusión de tejidos para el cultivo de explantes

1. Agregue 500 μL de gel de cultivo tibio y sin solidificar a un pocillo en una placa de 24 pocillos y transfiera rápidamente los incisivos enteros disecados al pocillo. Agite la placa unas cuantas veces para enjuagar los incisivos.
2. Añadir 400 μL de gel de cultivo tibio y sin solidificar a una placa de cultivo y transferir los incisivos enjuagados a la placa.
   NOTA: Utilizamos una placa de cultivo disponible comercialmente que es compatible con la configuración de perfusión. Consulte el paso 6.4 para ver las opciones alternativas.
3. Oriente el incisivo para colocar la región del asa cervical (u otras regiones de interés) en el centro de la placa (Figura 2A, B) y ajuste la inclinación del incisivo apical para el plano de imagen deseado.
   NOTA: La orientación de los tejidos debe realizarse rápidamente antes de la gelificación completa.
4. Después de fijar el gel, use un par de pinzas finas para quitar cualquier gel en la parte superior de la región de interés para que no quede cubierto por el gel.
5. Agregue un volumen suficiente de medio de cultivo tibio pipeteándolo lentamente contra el borde de la placa para cubrir solo la muestra (~ 150 μL).
6. Trasladar el cultivo de explantes a una incubadora de cultivos celulares a 37 °C para permitir la sedimentación del tejido y el ajuste a las condiciones de cultivo durante 1 h.

6. Microscopía timelapse de explantes de incisivos

NOTA: En este experimento, utilizamos un microscopio vertical equipado con un objetivo de inmersión en agua de 25x que tiene una apertura numérica de 1. En general, una lente de inmersión en agua con una apertura numérica alta es la más adecuada para la obtención de imágenes de tejidos profundos.

1. Encienda el microscopio y el láser de dos fotones.
2. Fije la placa de cultivo al adaptador de platina y monte el anillo adaptador de perfusión en la parte superior (Figura 2C).
3. Conecte el adaptador de platina a un controlador de temperatura configurado para mantener el cultivo a 37 °C.
4. Conecte la entrada y la salida del anillo adaptador a una bomba de microperfusión y comience la perfusión del medio de cultivo, con la velocidad de perfusión establecida en 20 en la bomba. Esto genera un flujo lento (~5 mL/h) del medio de cultivo sobre la parte superior de las muestras (Figura 2C).
   NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre el sistema para mantener el tejido en un entorno controlado de manera estable. También se pueden utilizar otros sistemas. También se puede utilizar una combinación de una placa calefactora a 37 °C y una placa de cultivo de perfusión casera (figura complementaria S1) con una entrada y una salida conectadas a bombas de jeringa.
5. Coloque un anillo de barrera de control atmosférico (ACBR) en la parte superior del anillo adaptador y baje el objetivo a través del ACBR para hacer contacto con el medio de cultivo (Figura 2D).
6. Ajuste la longitud de onda del láser a 920 nm para visualizar las señales de GFP y fluorescencia roja (por ejemplo, tdTomato).
7. Localice las muestras a través de oculares y luego en el software del microscopio.
8. Configure pilas Z, imágenes de múltiples posiciones e intervalos de tiempo con el software. Para seguir este protocolo, utilice un tamaño de paso z de 4 μm y un intervalo de tiempo de 5 min durante 14 h.
   NOTA: Encontramos que un intervalo de tiempo de más de 5 minutos a menudo es insuficiente para capturar movimientos y divisiones celulares suaves.
9. Inicie las imágenes de lapso de tiempo.
   NOTA: La posición de la muestra puede cambiar durante la primera hora y es posible que se requieran ajustes adicionales.
10. Guarde archivos para el procesamiento y análisis de datos posteriores.

Resultados

La región apical del incisivo del ratón adulto está encerrada dentro de la mandíbula (Figura 1) y, por lo tanto, no es directamente accesible para visualizar y rastrear en vivo las células progenitoras que residen dentro de la región de crecimiento. Por lo tanto, hemos desarrollado un método para extraer todo el incisivo de la mandíbula y mantenerlo en un sistema de cultivo de explantes para microscopía timelapse de dos fotones (Figura 2). Aquí describ...

Discusión

La imagen de tejido vivo es una técnica importante que nos permite estudiar los procesos dinámicos y el comportamiento de las células cuando se mantienen en su entorno de nicho⁴¹. Idealmente, las imágenes en vivo se realizan in vivo con una alta resolución espacio-temporal. Sin embargo, la obtención de imágenes in vivo de órganos de mamíferos puede ser un reto debido a la inaccesibilidad de los tejidos, la opacidad óptica y la dificultad para inmovilizar al animal o al ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well, flat bottom tissue culture plate	Olympus plastics	25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	11507704
Ascorbic acid (Vitamin C)	Acros Organics	352685000
D-(+)-Glucose bioxtra	Sigma Aldrich	G7528
Delta T system	Bioptechs	0420-4	Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E	Leica	LED300 SLI
DMEM/F12	Thermo Scientific	11039047	Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15)	Feather	72044-15
Fine forceps	F.S.T	11252-23
Glutamax	Thermo Scientific	35050-061	Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective	Leica	n/a
low-melting agarose	NuSieve	50080
non-essential amino acids (100x)	Thermo Scientific	11140-050
penicillin–streptomycin	Thermo Scientific	15140122	10,000 U/mL
Petri dish	Gen Clone	32-107G	90 mm
Rat serum	Valley Biomedical	AS3061SC	Processed for live imaging
Razor blade #9	VWR	55411-050
Scalpel handle	F.S.T	10003-12
Scissors	F.S.T	37133
serrated forceps	F.S.T	11000-13
spring scissors	F.S.T	91500-09