Aplicación de grafeno monocapa a rejillas de criomicroscopía electrónica para la determinación de estructuras de alta resolución

Resumen

La aplicación de capas de soporte a rejillas de microscopía electrónica criogénica (crioEM) puede aumentar la densidad de partículas, limitar las interacciones con la interfaz aire-agua, reducir el movimiento inducido por el haz y mejorar la distribución de las orientaciones de las partículas. Este artículo describe un protocolo robusto para recubrir rejillas crioEM con una monocapa de grafeno para mejorar la preparación de muestras criogénicas.

Resumen

En la microscopía electrónica criogénica (cryoEM), las macromoléculas purificadas se aplican a una rejilla que lleva una lámina de carbono agujereada; A continuación, las moléculas se secan para eliminar el exceso de líquido y se congelan rápidamente en una capa de hielo vítreo de aproximadamente 20-100 nm de espesor, suspendida en agujeros de lámina de aproximadamente 1 μm de ancho. La muestra resultante se obtiene mediante microscopía electrónica de transmisión criogénica y, después del procesamiento de la imagen con un software adecuado, se pueden determinar estructuras de resolución casi atómica. A pesar de la adopción generalizada de la crioEM, la preparación de muestras sigue siendo un grave cuello de botella en los flujos de trabajo de la crioEM, ya que los usuarios a menudo se enfrentan a problemas relacionados con el mal comportamiento de las muestras en el hielo vítreo suspendido. Recientemente, se han desarrollado métodos para modificar las rejillas crioEM con una sola capa continua de grafeno, que actúa como una superficie de soporte que a menudo aumenta la densidad de partículas en el área de la imagen y puede reducir las interacciones entre las partículas y la interfaz aire-agua. Aquí, proporcionamos protocolos detallados para la aplicación de grafeno a las rejillas crioEM y para evaluar rápidamente la hidrofilicidad relativa de las rejillas resultantes. Además, describimos un método basado en EM para confirmar la presencia de grafeno mediante la visualización de su patrón de difracción característico. Finalmente, demostramos la utilidad de estos soportes de grafeno mediante la reconstrucción rápida de un mapa de densidad de resolución de 2,7 Å de un complejo Cas9 utilizando una muestra pura a una concentración relativamente baja.

Introducción

La microscopía electrónica criogénica de una sola partícula (crioEM) se ha convertido en un método ampliamente utilizado para visualizar^{macromoléculas} biológicas. Impulsado por los avances en la detección directa de electrones ^2,3,4, la adquisición de datos⁵ y los algoritmos de procesamiento de imágenes ^6,7,8,9,10, cryoEM es ahora capaz de producir estructuras 3D de resolución casi atómica d....

Protocolo

1. Preparación del grafeno CVD

1. Prepare la solución de grabado de grafeno como se describe a continuación.
   1. Disuelva 4,6 g de persulfato de amonio (APS) en 20 ml de agua de grado molecular en un vaso de precipitados de 50 ml para obtener una solución de 1 M y cúbralo con papel de aluminio. Deje que APS se disuelva por completo mientras continúa con el paso 1.2.
2. Prepare una sección de grafeno CVD para el recubrimiento de metacrilato de metilo (MMA). Corta con cuidado una sección cuadrada de grafeno CVD. Transfiera el cuadrado a un cubreobjetos (50 mm x 24 mm) dentro de una placa de Petri limpia y cúbralo durante el ....

Discusión

La preparación de muestras de CryoEM implica una serie de desafíos técnicos, ya que la mayoría de los flujos de trabajo requieren que los investigadores manipulen manualmente las rejillas frágiles con extremo cuidado para evitar dañarlas. Además, la posibilidad de vitrificación de cualquier muestra es impredecible; Las partículas a menudo interactúan con la interfaz aire-agua o con la lámina de soporte sólida que se superpone a las rejillas, lo que puede llevar a que las partículas adopten las orientaciones .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
250 mL beaker (3x)	Fisher	02-555-25B
50 mL beaker (2x)	Corning	1000-50
Acetone	Fisher	A949-4
Aluminum foil	Fisher	15-078-292
Ammonium persulfate	Fisher	(I17874
Coverslips 50 mm x 24 mm	Mattek	PCS-1.5-5024
CVD graphene	Graphene Supermarket	CVD-Cu-2x2
easiGlow discharger	Ted-Pella	91000S
Ethanol	Millipore-Sigma	1.11727
Flat-tip tweezers	Fisher	50-239-60
Glass cutter	Grainger	21UE26
Glass petri plate and cover	VWR	75845-544
Glass serological pipette	Fisher	13-676-34D
Grid Storage Case	EMS	71146-02
Hot plate	Fisher	07-770-108
Isopropanol	Sigma	W292907
Kimwipe	Fisher	06-666
Lab scissors	Fisher	13-806-2
Methyl-Methacrylate EL-6	Kayaku	MMA M310006 0500L1GL
Molecular grade water	Corning	46-000-CM
Negative action tweezers (2x)	Fisher	50-242-78
P20 pipette	Rainin	17014392
P200 pipette	Rainin	17008652
Parafilm	Fisher	13-374-12
Pipette tips	Rainin	30389291
Quantifoil grids with holey carbon	EMS	Q2100CR1
Spin coater	SetCas	KW-4A	with chuck SCA-19-23
Straightedge	ULINE	H-6560
Thermometer	Grainger	3LRD1
UV/Ozone cleaner	BioForce	SKU: PC440
Vacuum desiccator	Thomas Scientific	1159X11
Whatman paper	VWR	28297-216