Análisis por tomografía microcomputarizada de la rodilla en cobayas Dunkin-Hartley envejecidos después de una inyección intraarticular

Resumen

Los conejillos de indias Dunkin-Hartley son un modelo animal establecido para la investigación de la osteoartritis. Dichos estudios pueden beneficiarse de las inyecciones intraarticulares por varias razones, incluida la investigación de agentes nuevos o el tratamiento de enfermedades. Describimos una metodología para las inyecciones intraarticulares de rodilla en cobayas y el posterior análisis de microtomografía computarizada que evalúa los cambios de rodilla asociados a la artritis.

Resumen

El propósito de este protocolo es guiar a los investigadores en la realización de una técnica guiada por palpación de inyección intraarticular de rodilla en cobayas y evaluación mediante tomografía microcomputarizada. Los conejillos de indias Dunkin-Hartley son modelos robustos para la investigación de la osteoartritis, ya que desarrollan espontáneamente osteoartritis en las rodillas. La administración intraarticular de fármacos es un método común para estudiar los efectos de un fármaco en investigación in vivo. En los seres humanos, los agentes terapéuticos administrados a través de inyecciones intraarticulares pueden ofrecer alivio del dolor y retrasar la progresión de la osteoartritis. Al igual que con cualquier especie, la introducción de una aguja en un espacio articular tiene el potencial de causar lesiones, que pueden provocar dolor, cojera o infección. Tales eventos adversos pueden comprometer el bienestar animal, confundir los resultados del estudio y requerir animales adicionales para lograr los objetivos del estudio. Como tal, es imperativo desarrollar técnicas de inyección adecuadas para prevenir complicaciones, especialmente en estudios longitudinales que requieren inyecciones intraarticulares múltiples y repetidas. Utilizando la metodología presentada, cinco cuyes recibieron inyecciones bilaterales de rodilla bajo anestesia general. Siete días después de la inyección, los animales fueron sacrificados humanitariamente para analizar la gravedad de la osteoartritis. No se produjeron eventos adversos después de la anestesia o las inyecciones en la rodilla, como cojera, dolor o infección. El análisis de microtomografía computarizada de rayos X de la rodilla puede detectar cambios patológicos asociados con la osteoartritis. Los datos de la microtomografía computarizada indican que la osteoartritis es más grave en los animales de mayor edad, como lo indica el aumento de la densidad mineral ósea y el grosor trabecular con la edad. Estos resultados son consistentes con los cambios histológicos y las puntuaciones de Mankin modificado, un sistema de puntuación establecido y ampliamente utilizado para evaluar la gravedad de la artritis en estos mismos animales. Este protocolo se puede utilizar para refinar las inyecciones intraarticulares en conejillos de indias.

Introducción

La osteoartritis (OA) afecta a 32,5 millones de adultos estadounidenses. Está causada por la pérdida progresiva del cartílago articular, la inflamación leve de los tejidos dentro y alrededor de las articulaciones y la formación de osteofitos y quistes óseos ^1,2. Los síntomas suelen manifestarse en las últimas etapas de la enfermedad, y los tratamientos actuales solo proporcionan alivio paliativo y tienen efectos secundarios sistémicos. La falta de fármacos modificadores de la enfermedad se debe a una escasa comprensión de los mecanismos subyacentes de la enfermedad³. Como resultado, existe una necesidad médica crítica y continua de agentes mejorados para tratar la artrosis.

Existen varios modelos animales de OA que examinan diferentes componentes de los procesos de la enfermedad⁴. Si bien existen varios modelos quirúrgicos, como la transección del ligamento cruzado anterior y la desestabilización del menisco medial, estos son invasivos y requieren un alto nivel de habilidad técnica⁵. Los modelos inducidos químicamente son procedimientos comparativamente menos invasivos que se utilizan normalmente para estudiar los mecanismos del dolor de la artrosis⁶. Uno de estos modelos de ratón ampliamente utilizados consiste en la inducción de la artrosis mediante una inyección intraarticular de yodoacetato monosódico (MIA) en la rodilla. Este modelo genera un fenotipo similar al dolor reproducible, robusto y rápido que se puede graduar alterando la dosis de MIA⁷. Los detalles técnicos de la inducción de este modelo se han descrito anteriormente⁷. La traslación de esta técnica a roedores más grandes, como los conejillos de indias, es difícil debido a sus diferencias anatómicas. Algunas diferencias incluyen un aumento de la musculatura que rodea los huesos adyacentes y el espacio articular en el conejillo de indias y un peroné y una tibia articulados en comparación con la fusión distal observada en ratones⁸. Los conejillos de indias Dunkin-Hartley, una cepa de conejillos de indias ampliamente disponible, son un modelo animal establecido de OA ya que desarrollan naturalmente esta enfermedad, lo que ofrece un modelo sólido para investigar los efectos de nuevas terapias administradas por inyección intraarticular en la progresión de la enfermedad⁹. Los conejillos de indias Dunkin-Hartley comienzan a desarrollar OA a los tres meses, y los machos muestran un desarrollo acelerado y un fenotipo¹⁰ más severo. En los cobayos, la artrosis progresa con la edad y, a los 12 meses, la patología asociada es evidente en las imágenes¹¹. Los modelos de OA espontánea, como el modelo de Dunkin-Hartley, no requieren ninguna intervención para inducir OA y, por lo tanto, recapitulan el desarrollo y la progresión del fenotipo de la enfermedad en humanos, proporcionando así un potente modelo traslacional¹⁰. Además, el desarrollo espontáneo de la artrosis permite el control interno cuando se administran unilateralmente nuevas terapias en una sola rodilla de un animal determinado. Este control interno minimiza los efectos de las variabilidades entre animales al analizar los datos y puede ayudar a reducir el número total de animales.

El análisis de microtomografía computarizada de rayos X (μCT) es una herramienta poderosa que permite la evaluación cuantitativa de la gravedad de la OA¹². La μCT consiste en escanear múltiples imágenes de rayos X de alta resolución, obtenidas de una muestra giratoria o de una fuente de rayos X giratoria y un detector¹³. A continuación, se reconstruyen los datos volumétricos tridimensionales (3D) en forma de fragmentos de imagen apilados¹⁴. Debido a que el hueso mineralizado tiene un excelente contraste en μCT, esta modalidad se puede utilizar para evaluar las características 3D y realizar análisis cuantitativos de los cambios asociados con el OA 15,16,17. La μCT ofrece varias ventajas sobre las herramientas más utilizadas, como la histopatología y los análisis de la marcha. A diferencia de la evaluación histológica de una o pocas secciones de tejidos, la μCT explora toda la articulación y ofrece una evaluación más holística de las lesiones de artrosis¹⁸. Si bien el análisis de la marcha puede discernir cambios sintomáticos en la función articular con el tiempo, los cambios articulares se desarrollan mucho antes que los cambios funcionales asociados con la artrosis. La μCT puede proporcionar una medida más sensible del desarrollo de la artrosis antes de la aparición de la cojera. Dos mediciones cuantitativas especialmente relevantes son la densidad mineral ósea y el grosor trabecular, ya que ambas aumentan a lo largo de la progresión de la OA^19,20. Puede ser útil dividir el análisis en placa subcondral y hueso trabecular, ya que tienen características diferentes, para lograr mediciones y comparaciones más sólidas.

El objetivo general de este método es ayudar a los investigadores a realizar con éxito inyecciones intraarticulares en conejillos de indias. El protocolo presentado utilizó cuyes Dunkin-Hartley machos de cinco (n=2), nueve (n=1) y 12 (n=2) meses de edad; Los procedimientos se pueden extrapolar a otras cepas y edades de conejillos de indias que requieren inyecciones intraarticulares en la rodilla. En los modelos espontáneos de OA, como el modelo de Dunkin-Hartley, la progresión de la enfermedad y la respuesta al tratamiento en serie a menudo se monitorean durante largos períodos de tiempo, que abarcan de semanas a meses⁹. Este protocolo extendido da como resultado múltiples inyecciones intraarticulares y, por lo tanto, es importante contar con una técnica de inyección adecuada para prevenir eventos adversos, como dolor, cojera o infecciones, todos los cuales pueden afectar el bienestar animal y confundir los resultados del estudio, al tiempo que requieren animales adicionales en el estudio. El protocolo presentado describe la metodología de inyecciones intraarticulares en cobayas y el posterior análisis de los datos de μCT.

Protocolo

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Carolina del Sur. El estudio siguió el principio de las 3R.

1. Preparaciones de inyecciones intraarticulares

1. Permita que los conejillos de indias Dunkin-Hartley se aclimaten a las instalaciones durante al menos una semana antes de comenzar el experimento.
   NOTA: Se utilizaron cuyes machos de 5 (n=2), 9 (n=1) y 12 (n=2) meses de edad. Los machos muestran un desarrollo acelerado y un fenotipo más severo de OA.
2. Afeita el área de la rodilla con una maquinilla de afeitar eléctrica.
   NOTA: Tenga cuidado con los pezones medialmente.
3. Anestesiar al conejillo de indias en una cámara de isoflurano que administra una mezcla de isoflurano al 3-5% en O₂ (caudal de 2,5 L/min) y luego transferir al conejillo de indias a un cono de nariz conectado a un circuito de anestesia sin reinhalación. Ajustar el isoflurano para mantener el plano quirúrgico de anestesia durante la inyección, normalmente con un caudal de oxígeno de 0,5-1 L/min y 1-3% de isoflurano.
   NOTA: Las inyecciones intraarticulares causan un dolor leve y momentáneo. Los animales son anestesiados durante el procedimiento para evitar la percepción de estímulos dolorosos y mejorar la precisión de la inyección. En el estudio presentado, la administración de analgésicos, incluyendo antiinflamatorios no esteroideos, interferiría con la progresión de la OA²¹. Debido al dolor momentáneo, la anestesia proporcionada y el potencial de los analgésicos para confundir al modelo, no se administraron analgésicos a menos que los animales mostraran efectos secundarios, incluyendo cojera y signos de dolor a la palpación articular después de la inyección. Los investigadores deben considerar el uso de analgésicos para las inyecciones de rutina. Se recomiendan analgésicos cuando se presentan efectos secundarios. Los regímenes analgésicos deben ser discutidos con el veterinario institucional y aprobados por la IACUC antes de iniciar los estudios.
4. Asegúrese de que el conejillo de indias esté a la profundidad de anestesia adecuada por falta de respuesta de pellizco del dedo del pie.
5. Coloque lubricante ocular estéril en ambos ojos para prevenir la desecación y las lesiones.
6. Diluya betadine con agua estéril al 10%.
7. Diluya etanol de 200 grados con agua estéril hasta obtener etanol al 70%.
8. Preparar las soluciones inyectables, en una cabina de bioseguridad para mantener la esterilidad. En el protocolo presentado, se utilizó un vehículo estéril (solución salina tamponada con fosfato 1x) para inyectar ambas rodillas. Las soluciones se pueden cambiar en función de los objetivos de la investigación.
   NOTA: Asegúrese de diluir las soluciones frescas para inyección inmediatamente antes de la sesión de inyección para garantizar la esterilidad. Cualquier solución no utilizada debe desecharse al final de cada sesión de inyección.
9. Llene las jeringas estériles de insulina de un solo uso con soluciones inyectables. Tenga cuidado de utilizar el volumen más pequeño posible para evitar sobrecargar el espacio de la junta con volumen. En el presente estudio se utilizaron 50 μL.
10. Coloque el conejillo de indias y el cono de la nariz sobre una superficie limpia con una almohadilla térmica para soporte térmico y acolchado debajo de la cabeza para elevarla ligeramente.
11. Use bata quirúrgica, redecilla para el cabello, guantes estériles y mascarilla mientras realiza el procedimiento de inyección.
12. Vierta betadine al 10% en una bola de algodón y limpie ambas áreas de las rodillas.
13. Vierta etanol al 70% en una bola de algodón y limpie ambas áreas de las rodillas.
14. Repita 1.12 y 1.13 dos veces más.
    NOTA: Para fines de demostración, el video correspondiente muestra la limpieza de la rodilla y el sitio de inyección una vez con 10% de betadine y 70% de etanol. Posteriormente, el lugar de inyección se limpió con movimientos circulares dos veces más, alternando estas soluciones. Se recomiendan tres exfoliantes en serie alternando soluciones de exfoliante y alcohol para lograr una técnica aséptica.

2. Inyección intraarticular

1. Coloque al conejillo de indias en posición supina durante todo el procedimiento.
2. Póngase un nuevo par de guantes estériles y palpa la articulación de la rodilla.
   NOTA: En el protocolo presentado y en el video, se utilizaron guantes de nitrilo esterilizados en autoclave. Los guantes estériles, incluidos los guantes de nitrilo esterilizados en autoclave o los guantes quirúrgicos, deben utilizarse para la técnica aséptica.
3. Flexiona manualmente la rodilla a 90°.
4. Mueva el dedo distal a la rótula para ubicar el surco de la cara distal del espacio articular flexionando y extendiendo la extremidad posterior.
   NOTA: La rótula se puede palpar en esta posición como una estructura pequeña y firme ubicada directamente sobre el espacio articular. La tibia se puede sentir como una estructura ósea distal a la rótula. Una vez determinada la ubicación de la tibia y la rótula, la articulación, sentida como un surco, se encuentra entre ellas, distal a la rótula y proximal a la tibia.
5. Inserte la aguja de insulina con cuidado en la línea media distal a la rótula dentro del espacio articular. La aguja debe insertarse 1-2 mm por debajo de la piel para entrar en el espacio articular.
   NOTA: La ventana de acceso más grande para el espacio articular mientras la rodilla está flexionada se encuentra en la cara anterior de la extremidad en la línea media, directamente distal a la rótula. La inyección en la línea media en la dirección antero-posterior ayudará a inyectar con precisión en el espacio articular sin penetrar las estructuras óseas. La inyección precisa en el espacio articular se puede lograr utilizando un enfoque lateral a medial, aunque la ventana de acceso es más estrecha, especialmente cuando la rodilla está flexionada.
6. Inyecte lentamente 50 μL de la solución en la articulación. Asegúrese de que la aguja se inserte fácilmente y que el contenido se inyecte sin resistencia.
   NOTA: Asegúrese de no insertar la aguja demasiado profunda, ya que puede causar daños en las articulaciones o los huesos y provocar inflamación y / o dolor no deseados. Si no se encuentra el surco correspondiente al espacio articular, la aguja podría penetrar el fémur, la rótula o la tibia. Por lo tanto, es beneficioso palpar con confianza el surco correspondiente al espacio articular para evitar inyecciones periarticulares o lesiones asociadas con la penetración de estructuras óseas. Si se desarrolla una burbuja en el lugar de la inyección debajo de la piel, la inyección fue demasiado superficial y el líquido ha entrado en el espacio subcutáneo. Dependiendo de las propiedades del agente utilizado, el fármaco puede entrar en el espacio articular a través de la difusión, o puede ser necesario otro intento de inyección.
7. Una vez hecho esto, deseche la aguja en el contenedor de objetos punzantes.
   NOTA: Para fines de práctica y entrenamiento, inyecte líquido que contenga un tinte en el espacio articular de un cadáver en un roedor o conejillo de indias de tamaño similar. Luego, diseccione la articulación para confirmar la ubicación de la inyección.
8. Masajear la rodilla flexionando y extendiendo la articulación unas cuantas veces para promover la difusión del fármaco dentro del espacio articular.
9. Repita los pasos 2.1-2.5 una vez en la extremidad contralateral con 1x solución de PBS.

3. Recuperación de la inyección intraarticular

1. Apague el isoflurano y mantenga el 100% del flujo de oxígeno hasta que el animal recupere la conciencia.
2. Coloque al animal sobre una almohadilla térmica para soporte térmico hasta que deambule.
3. Aplique una compresa de hielo en la rodilla durante 30 segundos con una toalla de papel como barrera para ayudar a disminuir la hinchazón de la inyección.
4. Evalúe la marcha de los animales cuando están ambulatorios antes de devolverlos a la vivienda.
   NOTA: Si se observa alguna anomalía en la marcha, es posible que se justifiquen analgésicos y cuidados de apoyo. Es aconsejable volver a evaluar su marcha varias horas después de la recuperación de la anestesia para asegurar una movilidad normal.

4. Microtomografía computarizada (μCT)

1. Para la recolección de tejidos, establecer un plano quirúrgico de anestesia con 100% de oxígeno y 5% de mezcla de isoflurano.
2. Confirmar un plano quirúrgico de anestesia con falta de respuesta a un estímulo de pellizco en el dedo del pie. Sacrificar humanamente al animal mediante la administración de ≥ 150 mg/kg de pentobarbital por vía intravenosa de acuerdo con las políticas institucionales y el protocolo de uso animal aprobado.
   NOTA: En el protocolo presentado, cada uno de los cinco conejillos de indias recibió una inyección en ambas rodillas. Los animales fueron anestesiados y sacrificados humanitariamente una semana después de la inyección.
3. Cosecha ambas extremidades traseras diseccionando la piel lejos de la musculatura circundante.
4. A continuación, desarticule la extremidad posterior con Rongeurs en la diáfisis media del fémur y proximal al tobillo.
   NOTA: La cama de escaneo y el portamuestras utilizados no pudieron acomodar toda la extremidad trasera de un conejillo de indias adulto. Los soportes para muestras grandes están disponibles comercialmente para tamaños de muestras más grandes.
5. Colocar los tejidos en una solución de formalina neutra tamponada durante 72 h para su fijación antes de realizar la μCT.
6. Abra el software de escaneo de μCT y coloque la muestra con formalina en un recipiente compatible que quepa en la carpeta de muestras de μCT mientras mantiene el tejido en el campo de visión.
7. Calibre la máquina μCT para exposiciones de campo oscuro y campo claro de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.
8. Escanee la muestra con filtro Al+Cu a 18 μm. Utilice el paso de rotación de 0,7° para 360° con cámara offset.
   NOTA: El escaneo se guarda automáticamente.

5. Procesamiento de imágenes para la evaluación de parámetros microarquitectónicos óseos

1. Descargue e instale el software de reconstrucción μCT para la reconstrucción de imágenes μCT.
2. Seleccione la carpeta del software y haga doble clic para abrir el software.
3. Seleccione un sector de las imágenes μCT haciendo clic en un segmento de imagen.
4. Elija el destino del archivo de reconstrucción. Seleccione Examinar y cree una nueva carpeta denominada Reconocimiento. El formato de archivo seleccionado debe ser BMP(8).
5. Verifique la compensación de desalineación.
   NOTA: Por lo general, la estimación está cerca de ser correcta, pero se puede ajustar manualmente para cambiar las imágenes superpuestas de modo que los bordes derecho e izquierdo se alineen lo más posible.
6. En Configuración, aplique los algoritmos Suavizado, Endurecimiento del haz, Rotación CS y Artefactos de anillo .
   NOTA: Puede ser útil elegir una imagen de vista previa para determinar la claridad antes de reconstruir. La configuración de ajuste fino también puede ser útil para determinar qué configuraciones son las mejores.
7. Seleccione Iniciar para comenzar a procesar la reconstrucción.

6. Recopilación de datos microarquitectónicos a partir de imágenes reconstruidas

1. Descargue e instale Dataviewer.
2. Seleccione VOI y oriente la muestra para alinearla verticalmente y facilitar el análisis en un momento posterior.
3. Guarde el VOI editado como una nueva carpeta.
4. Descargue e instale CTAnalyser para el análisis de las propiedades óseas de los parámetros de microarquitectura.
   NOTA: La versión gratuita de CTAnalyser tiene una funcionalidad limitada, por lo que se recomienda obtener una licencia completa.
5. Divida el análisis en placa subcondral y hueso trabecular guardándolos como un rango separado de imágenes.
   NOTA: No es necesario dividir el análisis, pero debido a que la placa subcondral y el hueso trabecular tienen características diferentes, los análisis separados pueden ayudar con mediciones y comparaciones sólidas.
6. Seleccione el rango de imágenes a analizar, comenzando con la placa subcondral, haciendo clic en el corte de imagen con el que desea comenzar.
7. Seleccione la región de interés de cada imagen para asegurarse de que abarca el hueso haciendo clic en la pestaña de la región de interés.
8. Seleccione la pestaña Selección binaria . Ajuste el histograma para que el fondo y el hueso estén completamente separados.
9. Seleccione la pestaña Densidad mineral ósea (DMO). Guarde esos datos en una nueva carpeta de datos de análisis.
10. Seleccione Procesamiento personalizado y vaya a la pestaña Interno .
11. Primero realice Umbral y seleccione Otsu automático, luego Ejecutar.
12. A continuación, seleccione Despeckle , elija Eliminar motas negras y, a continuación, Run (Ejecutar).
13. Repita Despeckle y elija Eliminar manchas blancas y, a continuación, Ejecutar.
14. Elija Análisis 3D y seleccione Valores básicos y Valores adicionales.
15. Repita los pasos 6.2.2-6.4.5 para restablecer la imagen para el análisis del hueso trabecular.
    NOTA: Asegúrese de que el archivo de salida esté en una nueva carpeta con el mismo archivo que los datos BMD.

Resultados

Antes de realizar inyecciones intraarticulares en animales vivos, se practicó el protocolo anterior en tres cadáveres de ratas para garantizar el lugar correcto de la inyección. Durante las sesiones de práctica, se inyectaron 50 μL de colorante azul de metileno al 70% en ambas articulaciones de la rodilla utilizando la metodología descrita anteriormente. Esto equivale a seis inyecciones de práctica. Después de las inyecciones, la articulación de la rodilla se diseccionó mediante incisión a través de la cara c...

Discusión

A pesar de los avances recientes en el tratamiento sintomático de la OA, existe una falta total de agentes terapéuticos que prevengan la aparición o retrasen la progresión de la OA²⁴. En la actualidad, la única cura para la artrosis grave es el reemplazo articular, que es costoso, invasivo y puede provocar morbilidad y mortalidad del paciente²⁵. Como resultado, existe una necesidad imperiosa de continuar la investigación con modelos animales de OA y el desarrollo sost...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 Proof Ethanol	Decon Laboratories	2701	sterilizing agent
3D.SUITE software	Bruker		μ-CT analyzing software
Betadine Surgical Scrub	Avrio Health	67618-151-16	sterilizing agent
Insulin syringe with needle	Ulticare	91008	to perform injections
Isoflurane	Piramal	803249	anesthesize animal
Neutral Buffered Formalin	Fisher Scientific	23-427098	Fix tissue
Nrecon Software	Bruker		μ-CT reconstruction software
Phosphate Buffered Saline	Cytiva	SH30258.01	control and diluting agent
SkyScan 1176	Bruker		to scan samples