Aislamiento de células epiteliales pigmentarias primarias de la retina porcina para modelado in vitro

Resumen

Este protocolo describe el procedimiento para obtener y cultivar células epiteliales pigmentarias primarias de la retina (EPR) a partir de ojos porcinos de origen local. Estas células sirven como una alternativa de alta calidad a las células madre y son adecuadas para la investigación in vitro de la retina.

Resumen

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa crucial en la retina externa responsable de soportar los fotorreceptores. La degeneración del EPR ocurre comúnmente en enfermedades marcadas por la pérdida progresiva de la visión, como la degeneración macular relacionada con la edad (DMAE). La investigación sobre la DMAE a menudo se basa en ojos de donantes humanos o células madre pluripotentes inducidas (iPSC) para representar el EPR. Sin embargo, estas fuentes de EPR requieren períodos de diferenciación prolongados y una experiencia sustancial para el cultivo. Además, algunas instituciones de investigación, en particular las de las zonas rurales, carecen de fácil acceso a los ojos de los donantes. Si bien existe una línea celular de EPR inmortalizada disponible comercialmente (ARPE-19), carece de características esenciales de EPR in vivo y no es ampliamente aceptada en muchas publicaciones de investigación oftalmológica. Existe una necesidad apremiante de obtener células primarias representativas del EPR de una fuente más fácilmente disponible y rentable. Este protocolo dilucida el aislamiento y subcultivo de células primarias de EPR obtenidas post-mortem de ojos porcinos, que pueden obtenerse localmente de proveedores comerciales o académicos. Este protocolo requiere materiales comunes que normalmente se encuentran en los laboratorios de cultivo de tejidos. El resultado es una alternativa primaria, diferenciada y rentable a las iPSC, los ojos de donantes humanos y las células ARPE-19.

Introducción

El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa situada en la retina externa entre la membrana de Bruch y los fotorreceptores¹. Las células del EPR forman uniones estrechas con proteínas como la zonula occludens-1 (ZO-1) y poseen un fenotipo distintivo caracterizado por pigmentación y morfología hexagonal ^2,3. Estas células contribuyen a la barrera hematorretiniana, apoyando así la salud de los fotorreceptores y manteniendo la homeostasis de la retina ^4,5. Además, las células del EPR desempeñan un papel fundamental en....

Protocolo

Los ojos utilizados en este procedimiento se obtienen post mortem de una carnicería local inspeccionada por el USDA, y no se realiza ningún trabajo con animales vivos. Después de que los animales han sido sacrificados, pasan aproximadamente 2 horas antes de que los ojos sean enucleados. Dado que puede comenzar a producirse una caries en los tejidos, es importante mantener los ojos fríos durante el transporte para evitar más caries. En este procedimiento, los ojos se colocan inmediatamente en un refrigerador después de la enucleación. Posteriormente, la bolsa de ojos se coloca dentro de un vaso de polipropileno de 1000 mL y se rodea de hielo dentro de un enfriador de 8....

Discusión

Este protocolo describe cómo aislar las células del EPR de los ojos porcinos. La pigmentación y la morfología de los adoquines se observan a los 7 días del aislamiento (Figura 1B). Además, los datos de TEER indican la formación de uniones estrechas²² y una monocapa saludable (Figura 5). Estos resultados muestran que las células de EPR aisladas con este método son similares a las EPR humanas y pueden ser beneficiosas en modelos de.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Micro-well glass bottom plate with 14 mm micro-well #1 cover glass	Cellvis	P06-14-1-N
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062
Biosafety Cabinet
Calcium Chloride, Dried, Powder, 97%	Alfa Aesar	L13191.30
Cell Strainer	Fisher Scientific	22-363-548	one per eye
Centrifuge
Centrifuge Tubes, 15 mL	Fisher Scientific	05-539-12
Cooler, 8 L	Igloo	32529
Corning Transwell Multiple Well Plate with Permeable Polyester Membrane Inserts	Fisher Scientific	07-200-154	Culture inserts
Cut Resistant Glove	Dowellife	712971375857
Cytiva HyClone Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, Solution	Fisher Scientific	SH3026401	for ICC dilutions only
Deionized Water
DMEM, 1x with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV
DNase I from Bovine Pancreas	Sigma Aldrich	DN25
DPBS/Modified - calcium - magnesium	Cytiva	SH3002B.02	stored at 4 °C
ELISA kit, Q-Plex Human Angiogenesis (9-Plex)	Quansys Biosciences, Logan, UT
ENDOHM 6 TEER device	World Precision Instruments
Fetal Bovine Serum (FBS)	Avantor	232B20
Fisher BioReagents Bovine Serum Albumin (BSA) DNase- and Protease-free Powder	Fisher Scientific	BP9706100
Flashlight
Formaldehyde, ACS Grade, 36.5% (w/w) to 38.0% (w/w), LabChem	Fisher Scientific	LC146501
Gauze Sponges	Fisher Scientific	22-415-504	One per eye
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 647, Invitrogen	Thermo Scientific	A32728	RPE65 secondary antibody
Ice			Crushed prefered
Inverted Phase Contrast Microscope
Invitrogen NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	Fisher Scientific	R37605
Iris Fine Tip Scissors, Standard Grade, Curved, 4.5"	Cole-Palmer	EW-10818-05
Iris Scissors, 11 cm, Straight, Tungsten Carbide	Fisher Scientific	50-822-379
LSM-710 Confocal Microscope	Zeiss
Petri Dish, 100 mm x 20 mm	Corning	430167	one per 2-3 eyes and one for dissection surface/waste
Povidone-Iondine Solution, 10%	Equate	49035-050-34
RPE65 Monoclonal Antibody (401.8B11.3D9), Invitrogen	Thermo Scientific	MA116578	RPE65 primary antibody
Scalpel Blades Size 10	Fisher Scientific	22-079-683
Scalpel Handles Style 3	Fisher Scientific	50-118-4164
Surgical Drape, 18 x 26"	Fisher Scientific	50-209-1792
Tissue Culture Incubator			37 °C, 5% CO2, 95% Humidity
Tissue Culture Plates, 6 Wells	VWR	10062-892	One for eye wash and one for seeding
Tri-Cornered Polypropylene Beaker, 1000 mL	Fisher Scientific	14-955-111F
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Trypsin 0.25%, 2.21 mM EDTA in HBSS; w/o Ca, Mg, Sodium Bicarbonate	Corning	25053Cl
Tweezers Style 20A	Fisher Scientific	17-467-231
Tweezers Style 2A	Fisher Scientific	50-238-47	for removing neural retina
Tweezers Style 5-SA-PI	Fisher Scientific	17-467-168
Vacuum Aspiration System
Water Bath, 37 °C
ZO-1 Monoclonal Antibody (ZO1-1A12), FITC, Invitrogen	Fisher Scientific	33-911-1	ZO-1 conjugated primary antibody