Establecimiento y caracterización de organoides gástricos derivados de pacientes a partir de biopsias de cuerpo gástrico benigno y epitelio antral

Resumen

Los organoides gástricos derivados de pacientes encuentran un uso cada vez mayor en la investigación, sin embargo, faltan protocolos formales para generar organoides gástricos humanos a partir de digestión de una sola célula con densidad de siembra estandarizada. Este protocolo presenta un método detallado para crear organoides gástricos de forma fiable a partir de tejido de biopsia obtenido durante la endoscopia superior.

Resumen

Los organoides gástricos derivados del paciente (PDO) ofrecen una herramienta única para estudiar la biología y la patología gástrica. En consecuencia, estas DOP se utilizan cada vez más en una amplia gama de aplicaciones de investigación. Sin embargo, existe una escasez de enfoques publicados para producir PDO gástricas a partir de digestión de una sola célula, manteniendo al mismo tiempo una densidad de siembra celular inicial estandarizada. En este protocolo, se hace hincapié en la iniciación de organoides gástricos a partir de células individuales aisladas y en la provisión de un método para el paso de organoides a través de la fragmentación. Es importante destacar que el protocolo demuestra que un enfoque estandarizado para la densidad inicial de siembra celular produce organoides gástricos a partir de tejido de biopsia benigna y permite la cuantificación estandarizada del crecimiento de organoides. Por último, la evidencia apoya la nueva observación de que las PDO gástricas muestran tasas variables de formación y crecimiento en función de si los organoides se originan en biopsias del cuerpo o en regiones antrales del estómago. Específicamente, se revela que el uso de tejido de biopsia antral para la iniciación de organoides da como resultado un mayor número de organoides formados y un crecimiento más rápido de organoides durante un período de 20 días en comparación con los organoides generados a partir de biopsias del cuerpo gástrico. El protocolo descrito en este documento ofrece a los investigadores un método oportuno y reproducible para generar y trabajar con éxito con PDO gástricas.

Introducción

Los organoides son estructuras celulares tridimensionales (3D) en miniatura que se asemejan a la arquitectura y funcionalidad de los órganos de los que se derivaron ^1,2. Estos modelos cultivados en laboratorio se crean mediante el cultivo de células madre o células específicas de tejido en un entorno controlado que permite que estas células se autoorganicen y se diferencien en varios tipos de células ^1,2,3. Una de las principales ventajas de los organoides es su capacidad para recapitular la biología humana más de cer....

Protocolo

Todo el tejido humano utilizado en este protocolo se recolectó de personas que dieron su consentimiento informado para la recolección de tejido a través de un estudio de recolección de tejido gástrico aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Pensilvania (IRB #842961). Los participantes en este estudio debían someterse a una endoscopia superior como parte de su atención de rutina, tener al menos 18 años de edad y ser capaces de proporcionar un consentimiento informado. Todas las investigaciones realizadas se adhirieron a las pautas establecidas por la Universidad de Pensilvania.

1. Preparación experimental

Discusión

En este trabajo se describe un protocolo detallado para generar de forma fiable organoides gástricos humanos a partir de células individuales aisladas de biopsias de epitelio benigno del cuerpo gástrico y el antro. Los pasos críticos en el protocolo giran en torno al tiempo, así como al manejo de la matriz de la membrana basal. Para preservar la viabilidad, es fundamental iniciar el protocolo lo antes posible después de adquirir el tejido de la biopsia. El objetivo es comenzar a digerir el tejido de la biopsia dent.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R&D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amphotericin B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicin	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazole	MP Biomedicals	155710
N2 Supplement	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R&D Systems	DY4120-05
Wnt-3a ELISA Kit	R&D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503