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Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para aplicar un campo eléctrico de pulso de nanosegundos (nsPEF) para estimular células de Schwann in vitro. La capacidad de síntesis y secreción de factores relevantes y los cambios en el comportamiento celular validaron el éxito de la estimulación con nsPEF. El estudio ofrece una visión positiva del método de regeneración de los nervios periféricos.

Resumen

Las células de Schwann (SC) son células mielinizantes del sistema nervioso periférico que desempeñan un papel crucial en la regeneración de los nervios periféricos. El campo eléctrico de pulso de nanosegundos (nsPEF) es un método emergente aplicable en la estimulación eléctrica nerviosa que ha demostrado ser eficaz para estimular la proliferación celular y otros procesos biológicos. Con el objetivo de evaluar si las SC experimentan cambios significativos bajo nsPEF y ayudar a explorar el potencial de nuevos métodos de regeneración de nervios periféricos, las células RSC96 cultivadas se sometieron a la estimulación de nsPEF a 5 kV y 10 kV, seguidas de un cultivo continuo durante 3-4 días. Posteriormente, se evaluaron algunos factores relevantes expresados por los SC para demostrar el éxito de la estimulación, incluyendo la proteína marcador específica, el factor neurotrófico, el factor de transcripción y el regulador de la mielinización. Los resultados representativos mostraron que nsPEF mejoró significativamente la proliferación y migración de SC y la capacidad de sintetizar factores relevantes que contribuyen positivamente a la regeneración de los nervios periféricos. Al mismo tiempo, una menor expresión de GFAP indicó un pronóstico benigno de lesiones de los nervios periféricos. Todos estos resultados muestran que nsPEF tiene un gran potencial como método de tratamiento eficiente para las lesiones de los nervios periféricos mediante la estimulación de las SC.

Introducción

Cada año, millones de personas se ven afectadas por lesiones nerviosas que afectan tanto al sistema nervioso periférico (SNP) como al sistema nervioso central (SNC)1. Los estudios han demostrado que la capacidad de reparación axonal del SNC es bastante limitada después de lesiones nerviosas, mientras que el SNP muestra una mayor capacidad debido a la importante plasticidad de las SC2. Sin embargo, lograr la regeneración completa después de lesiones de nervios periféricos sigue siendo arduo y continúa planteando un desafío importante para la salud humana 3,4. Hoy en día, los autoinjertos han seguido siendo un tratamiento común a pesar de los inconvenientes de la morbilidad del sitio donante y la disponibilidad limitada5. Esta situación ha llevado a los investigadores a explorar terapias alternativas, como los materiales6, los factores moleculares7 y la estimulación eléctrica (SE). Como factor que promueve el crecimiento axonal y la regeneración nerviosa8, la elección de un método adecuado de CE y la exploración de la relación entre CE y SC se vuelven esenciales.

Las SC son las principales células gliales del SNP, desempeñando un papel crucial en la regeneración del SNP 9,10. Después de las lesiones de los nervios periféricos, las SC experimentan una activación rápida, una reprogramación extensa2 y la transición de un estado formador de mielina a una morfología de apoyo al crecimiento para llevar a cabo la regeneración del nervio2. En el extremo distal del nervio lesionado se produce una proliferación sustancial de SCs, mientras que las SCs del muñón distal experimentan proliferación y elongación para formar la banda de Bungner, que son necesarias para guiar los axones hacia el órgano diana11. Además, las SC de los muñones nerviosos proximales y distales migran hacia el puente nervioso para formar cordones SC que promueven la regeneración de axones12. Además, estudios previos han demostrado que la síntesis y secreción de factores relevantes relacionados con las SC cambian en casos de regeneración de nervios periféricos, incluidos los factores transcripcionales13, los factores neurotróficos14 y los reguladores de la mielinización13. Esto también proporciona indicadores para evaluar la actividad de las SC. Sobre la base de estos, la promoción de la proliferación, migración, síntesis y secreción de factores relevantes para mejorar la regeneración de los nervios periféricos15.

Estudios previos han demostrado la posibilidad de utilizar las CE para la regeneración nerviosa1. Una explicación ampliamente aceptada es que las ES pueden inducir la despolarización de las membranas celulares, alterar el potencial de membrana y afectar las funciones de las proteínas de membrana al cambiar las distribuciones de carga en estasbiomoléculas. Sin embargo, la PEF intensa ampliamente aplicada puede causar dolor intenso, contracciones musculares involuntarias y fibrilación cardíaca8. También aumenta la actividad de la creatina quinasa (CK), disminuye la fuerza muscular e induce el desarrollo de dolor muscular de aparición tardía (DOMS)16. nsPEF es una técnica emergente que estimula a los sujetos de prueba con campos eléctricos de alto voltaje dentro de una duración de pulso de nanosegundos, y se está utilizando gradualmente en la investigación a nivel celular17,18. Estudios previos han informado que la posible razón de ser de nsPEF que promueve la proliferación celular y la actividad de orgánulos es la formación de nanoporos de membrana y la activación de canales iónicos, lo que conduce a un aumento en la concentración citoplasmática de Ca2+ 19. nsPEF utiliza la tecnología de potencia de pulso para cargar la membrana celular, produciendo pulsos caracterizados por una corta duración, un rápido tiempo de subida, alta potencia y baja densidad de energía20. Estas características sugieren que la nsPEF puede ser un modo preferido con efectos secundarios de estimulación mínimos8. Además, nsPEF ofrece ventajas como procedimientos mínimamente invasivos, reversibilidad, capacidad de ajuste y no destructividad para los tejidos neurales en comparación con las intervenciones quirúrgicas. Una de las principales líneas de investigación de la nsPEF en el campo biomédico es su aplicación para la ablación de tejido tumoral mediante estimulación de campo eléctrico de alta energía 21,22,23. Algunos resultados de investigación indican que el 12-nsPEF puede estimular los nervios periféricos sin causar daño24. Sin embargo, en la actualidad, existe evidencia limitada con respecto a la aplicación de nsPEF en el campo de la regeneración nerviosa. Además, la estimulación de las SC mediante nsPEF es un intento pionero que contribuye a una mayor investigación clínica e in vivo. Este estudio explora si la estimulación de nsPEF de las SC puede promover la regeneración nerviosa y proporcionar una base fiable para posteriores investigaciones profundas y sistemáticas.

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Protocolo

1. Descongelación de células RSC96 criopreservadas

  1. Descongele el criovial que contiene 1 mL de suspensión celular agitándolo rápidamente en un baño de agua a 37 ° C, y luego agréguelo a un tubo de centrífuga que contenga 4-6 mL de medio de cultivo completo y mezcle bien.
  2. Centrifugar a 1000 x g durante 3-5 min, desechar el sobrenadante y resuspender las células en 3 mL de medio de cultivo completo.
  3. Añadir la suspensión celular a un matraz (o plato) de cultivo que contenga 6-8 mL de medio de cultivo completo e incubar a 37 °C durante la noche.
  4. Al día siguiente, observe el crecimiento y la densidad celular bajo un microscopio.

2. Paso de la celda:

NOTA: Si la densidad celular alcanza el 80%-90%, está lista para el paso.

  1. Deseche el medio de cultivo y enjuague las células 1-2 veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin iones de calcio y magnesio.
  2. Añadir 0,25% (p/v) de tripsina-0,53 mM de EDTA al matraz de cultivo (1-2 mL para un matraz T25, 2-3 mL para un matraz T75) e incubar a 37 °C durante 1-2 min.
  3. Observe el desprendimiento de células bajo un microscopio. Si la mayoría de las células se vuelven redondas y se desprenden, regrese rápidamente el matraz al área de trabajo, golpee suavemente el matraz y agregue 3-4 ml de medio de cultivo que contenga 10% de FBS para detener la digestión.
  4. Mezclar el contenido, aspirar la solución y centrifugar a 1000 x g durante 5 min. A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células añadiendo 1-2 ml de medio de cultivo fresco y pipeteando suavemente.
  5. Transfiera la suspensión celular a un nuevo matraz T25 en una proporción de 1:2 y agregue 7 mL de medio de cultivo.

3. Funcionamiento del dispositivo nsPEF

  1. Resuspenda las células RSC96 en 1 mL de medio de cultivo DMEM y transfiéralas a placas colorimétricas con electrodos en ambos lados.
  2. Encienda el interruptor de encendido.
  3. Ajuste los parámetros girando la perilla del instrumento para alterar la intensidad del campo eléctrico. Las intensidades establecidas en este estudio son 5 kV/cm, 10 kV/cm, 20 kV/cm y 40 kV/cm.
  4. Gire con cuidado los electrodos hasta que aparezcan chispas, permitiendo que las celdas reciban 5 pulsos de nsPEF de acuerdo con las intensidades de intensidad de campo preestablecidas antes de separar inmediatamente los dos electrodos. Después de este tratamiento, tome las células del grupo experimental tratadas con nsPEF y las células del grupo control no tratadas para realizar las secciones 4-6, respectivamente, después de un cierto período de cultivo celular (1 día en este experimento).

4. Ensayo del kit de recuento de células-8 (CCK-8)

  1. Prepare una suspensión celular de una concentración particular a partir de células RSC96 estimuladas con estimulación eléctrica. Agregue 100 μL de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de cultivo celular de 96 pocillos. Teniendo en cuenta los requisitos del ensayo CCK-8, controle el número total de células en el kit de reactivos entre 1 x 103 y 1 x 106.
  2. Tome 10 μL de solución CCK-8 del kit y agréguela a la placa de cultivo celular de 96 pocillos. Incubar en una incubadora deCO2 a 37 °C durante 30 minutos a 4 horas adicionales.
  3. Mide la absorbancia. Utilice la medición de doble longitud de onda con una longitud de onda de detección de 430-490 nm y una longitud de onda de referencia de 600-650 nm.
  4. Determinar la intensidad de campo para experimentos posteriores en función de los resultados experimentales de la proliferación celular. Seleccione células con buena proliferación para experimentos posteriores.

5. Ensayo de rasguño celular

  1. En cada pocillo de una placa de seis pocillos, siembre 3 x 105 celdas con un volumen total de 2 mL por pocillo. Aproximadamente 72 h después, las celdas cubrirán el pozo. Realice la prueba en el grupo experimental y en el grupo de control por separado.
  2. Utilice la punta de una pipeta para dibujar una línea horizontal en la parte inferior del pocillo de cultivo. Asegúrese de que la punta de la pipeta esté sujeta verticalmente y trate de evitar inclinarla.
  3. Aspire el medio de cultivo y lávelo con PBS 2-3 veces.
  4. Agregue 2 mL de medio sin suero a cada pocillo.
  5. Coloque la placa en la incubadora a 37 °C. Tome fotografías con un aumento cuádruple del microscopio invertido a 0 h y 24 h para observar los cambios en la migración celular.

6. Inmunofluorescencia

  1. Permeabilización celular:
    1. Después de pipetear suavemente las suspensiones celulares en placas de cultivo, dibuje círculos con un bolígrafo de histología en los lugares donde las células se distribuyen uniformemente en el cubreobjetos. Tratar el grupo de control y los diferentes grupos experimentales por separado.
    2. Añadir 50-100 μL de solución de trabajo de permeabilización (0,25-0,5% Triton X-100) e incubar a temperatura ambiente (RT) durante 20 min. Lavar tres veces con PBS durante 5 minutos cada vez.
  2. Bloqueo del suero: Agregue un 3% de BSA dentro de los círculos para cubrir el tejido de manera uniforme. Incubar en RT durante 30 min.
  3. Incubación de anticuerpos primarios: Retire suavemente la solución de bloqueo y agregue el anticuerpo primario diluido adecuadamente (derivado de ratón, diluido a 1:300) a los pocillos celulares. Coloque la placa de cultivo celular en una caja húmeda e incube durante la noche a 4 °C.
  4. Incubación secundaria de anticuerpos: Coloque la placa celular en un agitador y lávela tres veces durante 5 minutos cada vez. Añadir el anticuerpo secundario correspondiente (IgG anti-ratón de cabra marcado con CY3, diluido a 1:300) e incubar a RT durante 50 min.
  5. Tinción nuclear DAPI:
    1. Coloque el cubreobjetos en PBS (pH 7.4) en una coctelera y lave tres veces durante 5 minutos cada vez.
    2. Después de secar suavemente el portaobjetos, añada la solución de tinción DAPI (2 μg/mL, 0,5 mL por círculo) dentro de los círculos e incube a RT durante 10 min en una habitación oscura.
  6. Montaje: Coloque el cubreobjetos en PBS (pH 7.4) en una coctelera y lávelo tres veces durante 5 minutos cada vez. Después de secar suavemente el portaobjetos, selle el cubreobjetos con un medio de montaje antidecoloración para la fluorescencia.
  7. Adquisición de imágenes: Excite DAPI a una longitud de onda de 330-380 nm y detecte la emisión a 420 nm; excitar a 465-495 nm y detectar la emisión a 515-555 nm para AF488; excitar a 510-560 nm y detectar la emisión a 590 nm para CY3; excitar a 608-648 nm y detectar la emisión a 672-712 nm para CY5.

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Resultados

Los campos eléctricos pulsados de baja intensidad estimulan la proliferación celular
Según el ensayo CCK-8, la tasa de proliferación de RSC96 en el grupo de 5 kV/cm fue significativamente más rápida que la de las células del grupo de control. Sin embargo, a medida que aumentaban los parámetros (20 kV/cm y 40 kV/cm), la tasa de proliferación era inestable, incluso inferior a la del grupo control. La tasa de proliferación celular de las células RSC96 en el grupo de 40 kV/cm fue significativam...

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Discusión

En los últimos años, la aplicación de nsPEF ha experimentado un impulso al crecimiento, como se informó. nsPEF tiene un efecto altamente dirigido solo en el área deseada, proporcionando suficiente energía para tratar sin causar daño térmico adicional, lo que lo hace más seguro para el cuerpo humano28. Estas características le confieren prometedoras perspectivas traslacionales en el tratamiento de tumores y la regeneración nerviosa. Sin embargo, algunos estudios han propuesto algunas lim...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por el Proyecto Nacional de Desarrollo de Instrumentos y Equipos Científicos Clave (NO.82027803).

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Antifade mounting mediumWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1401
Anti-GFAP Mouse mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB12100-100
Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB12144-100
Anti-S100 beta Mouse mAbWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB14146-100
BSAWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGC305010
CoverslipJiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD10212432C
CY3-labeled goat anti-mouse IgGWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDGB21302
DAPI Staining ReagentWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1012
Decolorizing shakerWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDDS-2S100
High Voltage Power Supply for nsPEFMatsusada Precision Inc.AU-60P1.6-L
Histochemical penWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG6100
Membrane breaking liquidWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG1204
Microscope slideWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG6012
Palm centrifugeWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDMS6000
PBS powderedWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDG0002
PipetteWuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positive fluorescence microscopeNikon, JapanNIKON ECLIPSE C1
Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibodyBeijing Bioss Biotechnology Co., LTDBS-20563R-AF488
RSC96 Schwann cellsWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDSTCC30007G-1
scanister3DHISTECHPannoramic MIDI
Special cable for nsPEFTimes Microwave SystemsM17/78-RG217
Turbine mixerWuhan Xavier Biotechnology Co., LTDMV-100

Referencias

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