Observación directa y medición automatizada de las respuestas estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 en Arabidopsis thaliana

Resumen

Aquí, presentamos un método simple para la observación directa y la medición automatizada de las respuestas estomáticas a la invasión bacteriana en Arabidopsis thaliana. Este método aprovecha un dispositivo portátil de imágenes estomáticas, junto con una canalización de análisis de imágenes diseñada para imágenes foliares capturadas por el dispositivo.

Resumen

Los estomas son poros microscópicos que se encuentran en la epidermis de las hojas de las plantas. La regulación de la apertura estomática es fundamental no solo para equilibrar la absorción de dióxido de carbono para la fotosíntesis y la pérdida transpiracional de agua, sino también para restringir la invasión bacteriana. Mientras que las plantas cierran los estomas al reconocer los microbios, las bacterias patógenas, como Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 (Pto), vuelva a abrir los estomas cerrados para acceder al interior de la hoja. En los ensayos convencionales para evaluar las respuestas de los estomas a la invasión bacteriana, las cáscaras epidérmicas de las hojas, los discos de las hojas o las hojas desprendidas flotan en suspensión bacteriana, y luego los estomas se observan bajo un microscopio seguido de una medición manual de la apertura de los estomas. Sin embargo, estos ensayos son engorrosos y es posible que no reflejen las respuestas estomáticas a la invasión bacteriana natural en una hoja adherida a la planta. Recientemente, se desarrolló un dispositivo de imagen portátil que puede observar los estomas pellizcando una hoja sin separarla de la planta, junto con una tubería de análisis de imágenes basada en el aprendizaje profundo diseñada para medir automáticamente la apertura de los estomas a partir de imágenes de hojas capturadas por el dispositivo. Aquí, sobre la base de estos avances técnicos, se presenta un nuevo método para evaluar las respuestas estomáticas a la invasión bacteriana en Arabidopsis thaliana . Este método consta de tres sencillos pasos: inoculación por pulverización de Pto imitando los procesos naturales de infección, observación directa de los estomas en una hoja de la planta inoculada con Pto utilizando el dispositivo portátil de obtención de imágenes y medición automatizada de la apertura estomática mediante la tubería de análisis de imágenes. Este método se utilizó con éxito para demostrar el cierre y la reapertura de los estomas durante la invasión de la toma de fuerza en condiciones que imitan de cerca la interacción natural planta-bacteria.

Introducción

Los estomas son poros microscópicos rodeados por un par de células protectoras en la superficie de las hojas y otras partes aéreas de las plantas. En entornos en constante cambio, la regulación de la apertura estomática es fundamental para que las plantas controlen la absorción de dióxido de carbono necesaria para la fotosíntesis a expensas de la pérdida de agua a través de la transpiración. Por lo tanto, la cuantificación de la apertura estomática ha sido fundamental para comprender la adaptación ambiental de las plantas. Sin embargo, cuantificar la apertura estomática es inherentemente lento y engorroso, ya que requiere trabajo humano para detectar y medir los poros....

Protocolo

1. Cultivo de plantas

1. Para romper la latencia, resuspender las semillas de A. thaliana (Col-0) en agua desionizada e incubarlas a 4 °C durante 4 días en la oscuridad.
2. Siembre las semillas en el suelo y crezca en una cámara equipada con luz fluorescente blanca. Mantener las siguientes condiciones de crecimiento: temperatura de 22 °C, intensidad lumínica de 6.000 lux (aprox. 100 μmol/m²/s) durante 10 h y humedad relativa del 60%.
3. Cuando sea necesario, riegue las plantas con un fertilizante líquido. Abstenerse de regar de 1 semana a 2 días antes de la inoculación y regar bien 1 día antes de la inoculación....

Resultados

Después de la inoculación por aspersión de Pto, los estomas en las hojas adheridas a las plantas inoculadas fueron observados directamente por el dispositivo portátil de imágenes estomáticas. Utilizando mediciones manuales y automatizadas, se utilizaron las mismas imágenes de las hojas para calcular la apertura de los estomas tomando proporciones de ancho a largo de aproximadamente 60 estomas. Las mediciones manuales y automatizadas indicaron consistentemente una disminución en la apertura estomática en.......

Discusión

Estudios previos utilizaron cáscaras epidérmicas, discos foliares u hojas desprendidas para investigar las respuestas estomáticas a las invasiones bacterianas ^9,11,12. Por el contrario, el método propuesto en este estudio aprovecha el dispositivo portátil de imágenes estomáticas para observar directamente los estomas en una hoja adherida a la planta después de la inoculación por aspersión de Pto, imitando las .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Nakarai tesque	01028-85
Airbrush kits	ANEST IWATA	MX2900	Accessory kits for SPRINT JET
Biotron	Nippon Medical & Chemical Instruments	LPH-411S	Plant Growth Chamber with white fluorescent light
Glycerol	Wako	072-00626
Half tray	Sakata	72000113	A set of tray and lid
Hyponex	Hyponex	No catalogue number available	Dilute the solution of Hyponex at a ratio of 1:2000 in deionized water for watering plants
Image J	Natinal Institute of Health	Download at https://imagej.nih.gov/ij/download.html	Used for manual measurement of stomatal aperture
K2HPO4	Wako	164-04295
KCl	Wako	163-03545
KOH	Wako	168-21815	For MES-KOH
MES	Wako	343-01621	For MES-KOH
Portable stomatal imaging device	Phytometrics	Order at https://www.phytometrics.jp/	Takagi et al.(2023) doi: 10.1093/pcp/pcad018.
Rifampicin	Wako	185-01003	Dissolve in DMSO
Silwet-L77	Bio medical science	BMS-SL7755	silicone surfactant used in spray inoculation
SPRINT JET	ANEST IWATA	IS-800	Airbrush used for spray inoculation
SuperMix A	Sakata seed	72000083	Mix with Vermiculite G20 in equal proportions for preparing soil
Tryptone	Nakarai tesque	35640-95
Vermiculite G20	Nittai	No catalogue number available	Mix with Super Mix A in equal proportions for preparing soil
White fluorescent light	NEC	FHF32EX-N-HX-S	Used for Biotron