Reutilización de tubos ultracentrífugos de policarbonato en análisis proteómicos de vesículas extracelulares

Resumen

Se proporciona un protocolo detallado para la limpieza y reutilización de los tubos de ultracentrífuga de policarbonato para realizar el aislamiento de vesículas extracelulares adecuado para experimentos de proteómica.

Resumen

Los plásticos de laboratorio de un solo uso agravan la crisis de contaminación y contribuyen a los costes de los consumibles. En el aislamiento de vesículas extracelulares (EV), se utilizan tubos de ultracentrífuga (UC) de policarbonato para soportar las altas fuerzas centrífugas asociadas. La proteómica de los vehículos eléctricos es un campo en avance y faltan protocolos de reutilización validados para estos tubos. La reutilización de consumibles para protocolos de aislamiento de proteínas de bajo rendimiento y proteómica posterior requiere compatibilidad de reactivos con las adquisiciones de espectroscopia de masas, como la ausencia de contaminación por polímeros sintéticos derivados del tubo de centrífuga y la eliminación suficiente de proteínas residuales.

Este protocolo describe y valida un método para limpiar tubos de UC de policarbonato para su reutilización en experimentos de proteómica de vehículos eléctricos. El proceso de limpieza implica la inmersión inmediata de los tubos de UC en_H2Opara evitar el secado de las proteínas, el lavado con detergente dodecil sulfato de sodio (SDS) al 0,1%, el enjuague con agua caliente del grifo, agua desmineralizada y etanol al 70%. Para validar el protocolo de reutilización de tubos de UC para la proteómica de EV aguas abajo, se obtuvieron tubos usados después de un experimento en el que se aislaron VE del tejido cardiovascular utilizando CU diferencial y separación por gradiente de densidad. Los tubos se limpiaron y el proceso experimental se repitió sin muestras de EV, comparando tubos de UC en blanco nunca utilizados con tubos de UC limpios. Los gránulos de pseudo-EV obtenidos de los procedimientos de aislamiento se lisaron y se prepararon para cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem utilizando un kit comercial de preparación de muestras de proteínas con modificaciones para muestras de proteínas de baja abundancia.

Después de la limpieza, el número de proteínas identificadas se redujo en un 98% en el pseudo-pellet en comparación con la muestra de aislamiento EV anterior del mismo tubo. Al comparar un tubo limpio con un tubo en blanco, ambas muestras contenían un número muy pequeño de proteínas (≤20) con un 86% de similitud. Se confirmó la ausencia de picos poliméricos en los cromatogramas de los tubos limpios. En última instancia, la validación de un protocolo de limpieza de tubos UC adecuado para el enriquecimiento de los VE reducirá los residuos producidos por los laboratorios de VE y reducirá los costes experimentales.

Introducción

Las vesículas extracelulares (VE) son partículas delimitadas por bicapas lipídicas liberadas por las células que transportan carga biológicamente activa, como proteínas, y participan en diversos procesos biológicos, incluida la comunicación célula-célula y la formación de^{mineralización biológica}. Estas partículas se encuentran en todos los fluidos y tejidos corporales, y sus actividades y usos biológicos son un campo de investigación científica en rápida evolución. El aislamiento y la validación de estas nanopartículas presentan varios desafíos debido a su pequeño tamaño y biosimilitud con otras partículas, como liposomas y agregados de proteín....

Protocolo

1. Limpieza de tubos

NOTA: El procedimiento de aislamiento de EV utiliza tubos UC de policarbonato con tapa y sin tapa (detallados a continuación). Se siguió el mismo procedimiento para los tubos tapados y sin tapa. En el caso de los tubos tapados, las piezas de la tapa se limpiaron individualmente y se volvieron a montar después del secado y el almacenamiento previo.

1. Después del uso inicial de los tubos de policarbonato y la extracción de la muestra, sumerja inmediatamente los tubos de UC en agua del grifo para evitar que la muestra se seque hacia el costado del tubo.
2. Transfiera y sumerja los tubos en d....

Discusión

Aquí describimos y validamos un protocolo para la limpieza de tubos UC de policarbonato para aplicaciones proteómicas y de enriquecimiento de EV. Demostramos la eliminación exitosa de la proteína residual de la muestra de tubo UC anterior en comparación con un análisis de pseudo-gránulos limpios por debajo del límite de detección de este protocolo de adquisición de espectrometría de masas y mostramos la similitud proteómica del tubo de UC en blanco nunca utilizado en comparación con los pseudo gránulos de t.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube	Beckman Coulter Life Sciences	355630	uncapped ultracentrifuge tube(s)
10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly	Beckman Coulter Life Sciences	355603	capped ultracentrifuge tube(s)
an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm	ThermoFisher Scientific	164946 and ES902	Dual column setup
Critical Swab Swab, Cotton Head	VWR	89031-270	cotton swab
Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump.	ThermoFisher Scientific	BRE725533	Mass spectrometer
Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022)	NA	NA	Human database
MilliQ water			water
PreOmics iST kit	PreOmics	P.O.00027	commercial protein sample preparation kit
Proteome Discoverer  package (PD, Version 2.5)	ThermoFisher Scientific	NA	Proteomic search software
SEQUEST-HT search algorithm	NA	NA	Search algorithm
Sodium Dodecyl Sulfate (20%)	Boston BioProducts	BM-230	detergent