Producción de Matriz Extracelular Cardíaca a partir de Fibroblastos Humanos Adultos para el Recubrimiento de Placas de Cultivo

Resumen

Los fibroblastos aislados del corazón humano adulto se cultivaron para confluir en placas recubiertas de gelatina para producir la matriz extracelular específica del miocardio. Después de la descelularización, este sustrato se puede utilizar para el cultivo y estudio de otras células cardíacas y las interacciones célula-matriz.

Resumen

El miocardio está compuesto por cardiomiocitos y un número aún mayor de fibroblastos, siendo estos últimos los responsables de la producción de la matriz extracelular. Desde las primeras etapas del desarrollo del corazón a lo largo de la vida, tanto en condiciones normales como patológicas, la composición de la matriz extracelular cambia e influye en la estructura y función del miocardio. El objetivo del método aquí descrito es obtener el sustrato para el cultivo de células cardíacas in vitro (denominado MEC cardíaca), imitando la matriz extracelular miocárdica in vivo. Con este fin, se cultivaron fibroblastos aislados del corazón humano adulto para que confluyeran en placas recubiertas de gelatina para producir la matriz extracelular específica del miocardio. La posterior extirpación de los fibroblastos cardíacos, al tiempo que se preservaba la MEC cardíaca depositada, produjo el sustrato para estudiar la influencia de la matriz extracelular específica del miocardio en otras células. Es importante destacar que la composición del recubrimiento derivado de fibroblastos de la placa de cultivo cambia de acuerdo con la actividad in vivo de los fibroblastos aislados del corazón, lo que permite estudios posteriores de las interacciones célula-matriz en diferentes condiciones normales y patológicas.

Introducción

Todas las células se encuentran in vivo en un microambiente especializado en el que pueden sobrevivir y llevar a cabo sus funciones específicas. Dentro de cualquier tejido, las células están rodeadas por una matriz extracelular compuesta por proteínas fibrilares y no fibrilares, y sustancias fundamentales ricas en glicosaminoglicanos¹. Los cambios cualitativos y cuantitativos en el contenido de la matriz influyen en la biología celular, controlando procesos como la proliferación celular, la apoptosis, la migración o la diferenciación. Por lo tanto, se invierten esfuerzos en la recreación de este microa....

Protocolo

Se obtuvieron tejidos cardíacos de pacientes con insuficiencia cardíaca terminal por cardiopatía isquémica que estaban en tratamiento con trasplante cardíaco. Todos los especímenes utilizados para los experimentos se recogieron con el consentimiento del paciente y sin identificadores de paciente, siguiendo los protocolos aprobados por el comité de ética de la Universidad de Nápoles Federico II y de acuerdo con los principios descritos en la Declaración de Helsinki. Los detalles de todos los reactivos y equipos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Prepar....

Discusión

Los fibroblastos aislados de muestras de corazón humano se cultivaron hasta la confluencia durante 21 días para sintetizar y depositar la matriz extracelular, formando una capa cohesiva firmemente adherida a la superficie de la placa de cultivo. La posterior extirpación de los fibroblastos cardíacos, al tiempo que se preservaba la MEC cardíaca depositada, produjo el sustrato para estudiar la influencia de la matriz extracelular específica del miocardio en otras células dentro del .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L laboratory bottle	VWR	215-1595	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate	VWR	391-0578	Clean and autoclave before use
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses	VWR	631-1570	Autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle	VWR	215-1593	Clean and autoclave before use
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle	VWR	215-1594	Clean and autoclave before use
60 mm plates	Falcon	353004	Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Sigma- Aldrich	338818	Liquid
Disposable scalpels	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin	Sigma- Aldrich	G1890-100G	Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors	Sigma- Aldrich	S3146	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
Stericup Filters	Millipore	S2GPU05RE	Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes
Triton X-100	Sigma- Aldrich	9002-93-1	Liquid
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes