Producción de Matriz Extracelular Cardíaca a partir de Fibroblastos Humanos Adultos para el Recubrimiento de Placas de Cultivo

Resumen

Los fibroblastos aislados del corazón humano adulto se cultivaron para confluir en placas recubiertas de gelatina para producir la matriz extracelular específica del miocardio. Después de la descelularización, este sustrato se puede utilizar para el cultivo y estudio de otras células cardíacas y las interacciones célula-matriz.

Resumen

El miocardio está compuesto por cardiomiocitos y un número aún mayor de fibroblastos, siendo estos últimos los responsables de la producción de la matriz extracelular. Desde las primeras etapas del desarrollo del corazón a lo largo de la vida, tanto en condiciones normales como patológicas, la composición de la matriz extracelular cambia e influye en la estructura y función del miocardio. El objetivo del método aquí descrito es obtener el sustrato para el cultivo de células cardíacas in vitro (denominado MEC cardíaca), imitando la matriz extracelular miocárdica in vivo. Con este fin, se cultivaron fibroblastos aislados del corazón humano adulto para que confluyeran en placas recubiertas de gelatina para producir la matriz extracelular específica del miocardio. La posterior extirpación de los fibroblastos cardíacos, al tiempo que se preservaba la MEC cardíaca depositada, produjo el sustrato para estudiar la influencia de la matriz extracelular específica del miocardio en otras células. Es importante destacar que la composición del recubrimiento derivado de fibroblastos de la placa de cultivo cambia de acuerdo con la actividad in vivo de los fibroblastos aislados del corazón, lo que permite estudios posteriores de las interacciones célula-matriz en diferentes condiciones normales y patológicas.

Introducción

Todas las células se encuentran in vivo en un microambiente especializado en el que pueden sobrevivir y llevar a cabo sus funciones específicas. Dentro de cualquier tejido, las células están rodeadas por una matriz extracelular compuesta por proteínas fibrilares y no fibrilares, y sustancias fundamentales ricas en glicosaminoglicanos¹. Los cambios cualitativos y cuantitativos en el contenido de la matriz influyen en la biología celular, controlando procesos como la proliferación celular, la apoptosis, la migración o la diferenciación. Por lo tanto, se invierten esfuerzos en la recreación de este microambiente para estudios in vitro de células de diferentes tejidos ^2,3.

El miocardio está formado por cardiomiocitos y una cantidad aún mayor de fibroblastos que desempeñan un papel fundamental en la producción y el mantenimiento de la matriz extracelular dentro del miocardio⁴. A lo largo de la vida, la composición de la matriz extracelular puede cambiar en respuesta a diversos factores normales y patológicos. Estas modificaciones en la composición de la matriz extracelular tienen un impacto significativo en la estructura y las características biomecánicas del miocardio⁵. En consecuencia, debería ser ventajoso para la comprensión de las interacciones célula-matriz dentro del miocardio humano si el microambiente específico de diferentes edades o condiciones patológicas se reprodujera in vitro ^6,7.

El método aquí descrito tiene como objetivo obtener el sustrato para el cultivo de células cardíacas in vitro (denominado MEC cardíaca), imitando la matriz extracelular miocárdica in vivo.

La investigación cardiovascular presenta desafíos específicos, incluyendo la dificultad para obtener muestras de donantes o pacientes vivos y cultivar células cardíacas humanas⁸. El método que aquí se presenta aborda estos desafíos al permitir la adquisición de fibroblastos cardíacos incluso a partir de pequeños fragmentos biópticos de miocardio humano y el cultivo de células cardíacas aisladas in vitro en su matriz extracelular nativa típica del miocardio humano.

Si bien los esfuerzos actuales se centran en el desarrollo de andamios 3D de polímeros sintéticos o naturales bioartificiales que imitan las propiedades biomecánicas del miocardio^{normal 9}, pasan por alto las interacciones célula-matriz y la señalización que ocurren tanto en condiciones normales como patológicas. Dado que la MEC cardíaca es sintetizada por fibroblastos cardíacos derivados del corazón humano, su composición está determinada por la actividad de estas células, que cambia en respuesta a diversas condiciones fisiológicas y patológicas, lo que permite estudiar su influencia específica en la biología de las células cardíacas¹⁰.

El protocolo actual fue diseñado específicamente para el tejido cardíaco humano, pero su base científica también debe aplicarse a otros órganos, especialmente aquellos con bajo potencial de regeneración, fibrosis intensa y cicatrices que influyen en la estructura y función general, así como un número y tamaño de muestra limitados.

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Protocolo

Se obtuvieron tejidos cardíacos de pacientes con insuficiencia cardíaca terminal por cardiopatía isquémica que estaban en tratamiento con trasplante cardíaco. Todos los especímenes utilizados para los experimentos se recogieron con el consentimiento del paciente y sin identificadores de paciente, siguiendo los protocolos aprobados por el comité de ética de la Universidad de Nápoles Federico II y de acuerdo con los principios descritos en la Declaración de Helsinki. Los detalles de todos los reactivos y equipos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación del experimento

1. Prepare herramientas/aparatos estériles: Un par grande de tijeras quirúrgicas, dos juegos de pinzas finas, dos pares de tijeras de microdisección, 1 frasco estéril de L, frasco estéril de 500 ml y un frasco estéril de 250 ml.
2. Desinfecte los cubreobjetos de 22 mm x 22 mm con etanol al 70% durante unos segundos. Aspirar el etanol con una pipeta serológica de 10 mL, dejar secar los cubreobjetos en el horno a 37 °C y esterilizarlos en autoclave.
3. Disuelva las sales en polvo disponibles comercialmente en agua estéril de doble destilación. En un frasco estéril de 1 L, agregue 0,35 g de polvo de bicarbonato de sodio para preparar 1 L de solución salina equilibrada (HBSS) de Hank a pH 7,4. Esterilice la solución utilizando membranas filtrantes de 0,22 μm bajo una campana estéril y almacene a 4 °C hasta su uso.
4. Pesar 0,1 g de fosfato de potasio monobásico, 4,0 g de cloruro de sodio, 0,1 g de cloruro de potasio y 0,575 g de fosfato de sodio dibásico para preparar 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x. Disuelva los componentes en agua bidestilada estéril y luego verifique el valor de pH (7.4). Esterilizar bajo una campana estéril por filtración y almacenar a 4 °C hasta su uso.
5. Añadir 5 mL de suero fetal bovino (FBS) a 45 mL de HBSS para preparar un volumen final de 50 mL de solución de parada de tripsina (TSS). Conservar a 4 °C hasta su uso.
6. Mida 223,75 mL de medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con 25 mL de FBS (concentración final, 10%) y agregue 1,25 mL de penicilina y solución de estreptomicina (pluma/estreptococo, concentración final, 0,5%) para preparar DMEM para el aislamiento y cultivo de fibroblastos. Conservar a 4 °C hasta su uso.
7. Prepare una solución de gelatina al 0,2% (p/v) añadiendo 0,2 g de gelatina de polvo de piel porcina a 100 ml de PBS.
   NOTA: Los componentes y las concentraciones respectivas para cada solución utilizada en el estudio se proporcionan en la Tabla 1.

2. Cultivo primitivo de fibroblastos cardíacos humanos por excrecencia a partir de fragmentos de miocardio auricular

NOTAS: Los pasos 2.2-2.3 deben realizarse en condiciones estériles. El protocolo está validado para muestras auriculares de aproximadamente 0,3 cm de diámetro, que es una dimensión típica para muestras de biopsia y permite el aislamiento de aproximadamente 2 x 10⁶ fibroblastos.

1. Lavar la muestra recién obtenida de la aurícula en una placa de vidrio de 100 mm con HBSS estéril, agitándola suavemente para eliminar la sangre. Repita este paso tres veces, cambiando el HBSS y la placa en cada lavado.
2. Colocar la muestra en un plato de 100 mm previamente humedecido con un pequeño volumen de HBSS y picar finamente con bisturíes cruzados hasta obtener cubos de unos 2 mm.
3. Coloque cuatro fragmentos pequeños de miocardio en una placa de 35 mm, lo suficientemente cerca como para que queden aproximadamente en los ángulos de un cubreobjetos de 22 mm x 22 mm, coloque el cubreobjetos estéril sobre los fragmentos, aplique una presión suave y agregue 1,5 ml de DMEM.
4. Incubar las placas de cultivo a 37 °C con CO₂ al 5% durante unos 15 días o hasta que las células alcancen el 85% de confluencia, comprobando diariamente el crecimiento de las células en un microscopio de contraste de fase invertida y cambiando el medio de cultivo cada 3 días.

3. Subcultivo de fibroblastos cardíacos humanos por tripsinización tibia

NOTAS: Los pasos que se informan a continuación deben realizarse en condiciones estériles. Dado que los fibroblastos pueden migrar desde el tejido explantado a lo largo de la superficie del vidrio de cobertura y la placa de cultivo, se recomienda procesar ambos para el primer subcultivo.

1. Levante el cubreobjetos con pinzas finas y estériles, colóquelo boca abajo en una placa nueva de 35 mm y enjuague con PBS estéril.
2. Retire los fragmentos de miocardio, deséchelos y enjuague la placa de 35 mm con células superadas con PBS estéril.
3. Deseche el enjuague y agregue 1 mL de tripsina-EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) al 0,25% a cada placa. Incubar durante 5 min a 37 °C con 5% de CO₂. Confirme el desprendimiento de células en un microscopio. Las células deben estar completamente redondeadas y separadas, formando pequeños grupos.
4. Bloquee la tripsinización añadiendo 2 mL de TSS a cada placa de 35 mm y recoja la suspensión en un tubo estéril de 15 mL, centrifugando a 400 x g durante 5 min a 4 °C.
5. Aspirar el sobrenadante con una pipeta serológica de 5 mL, resuspender el pellet en 3 mL de DMEM y colocar la suspensión celular en una placa de 60 mm.
6. Incubar las células obtenidas en el subcultivo 1 (o pasaje 1) en 3 mL de DMEM a 37 °C con 5% de CO₂, cambiando el medio cada tres días hasta que las células alcancen el 75% de confluencia.
7. Subcultive los fibroblastos que alcanzaron el 75% de confluencia, repitiendo la tripsinización en caliente y dividiendo las células 1:3 en nuevas placas de 60 mm hasta dos veces (pasajes 2 y 3).

4. Deposición de matriz extracelular

1. Preparar platos recubiertos de gelatina añadiendo 3 mL de solución estéril de gelatina al 0,2% a cada plato de 60 mm e incubando a 37 °C durante 2 h; luego aspire la solución y agregue 3 mL de PBS estéril hasta su uso.
2. Separar los fibroblastos cardíacos por tripsinización tibia y subcultivarlos a alta densidad (15 x 10,³ células por^cm2) en placas recubiertas de gelatina de 60 mm.
3. Cultive los fibroblastos en un estado confluente durante un máximo de 21 días, lo que permite la síntesis y deposición de la matriz extracelular. Reemplace el 50% del medio con medio nuevo cada 3 días.

5. Descelularización de la matriz extracelular

NOTA: Los pasos 5.3-5.4 deben realizarse agitando suavemente para desalojar solo las células sin desprender la matriz extracelular.

1. Preparar una solución de descelularización que contenga 0,25% de Triton X-100 y 10 mM de NH₄OH en PBS (calcular el volumen final, considerando 1 mL por cada placa de 60 mm).
2. Retire el medio de cultivo y enjuague las placas con PBS. Deseche el enjuague.
3. Añadir 1 mL de solución de descelularización y observar las placas en un microscopio de contraste de fase invertida; después de 1-2 minutos, cuando las células ya no sean discernibles, agregue suavemente 4 ml de PBS para diluir la solución de descelularización.
4. Retire la solución diluida y enjuague suavemente las placas con PBS; Deseche el enjuague.
5. Añada 1 ml de PBS y guarde las placas recubiertas de ECM a 4 °C hasta su uso posterior.

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Resultados

El crecimiento de los fibroblastos a partir de los pequeños fragmentos de miocardio nativo colocados en cultivo se observó en un plazo de 3 a 5 días (Figura 1).

En los días siguientes, el número de fibroblastos continuó aumentando, posiblemente debido al crecimiento sostenido de la muestra de tejido cardíaco y la proliferación de fibroblastos migrados en la superficie de la placa. No debe esperarse que todos los fragmentos...

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Discusión

Los fibroblastos aislados de muestras de corazón humano se cultivaron hasta la confluencia durante 21 días para sintetizar y depositar la matriz extracelular, formando una capa cohesiva firmemente adherida a la superficie de la placa de cultivo. La posterior extirpación de los fibroblastos cardíacos, al tiempo que se preservaba la MEC cardíaca depositada, produjo el sustrato para estudiar la influencia de la matriz extracelular específica del miocardio en otras células dentro del ...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 L laboratory bottle	VWR	215-1595	Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet	Falcon	357551	Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate	VWR	391-0578	Clean and autoclave before use
100 mm plates	Falcon	351029	Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes	Falcon	352097	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses	VWR	631-1570	Autoclave before use
25 mL serological pipet	Falcon	357525	Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle	VWR	215-1593	Clean and autoclave before use
35 mm plates	Falcon	353001	Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet	Falcon	357543	Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes	Falcon	352098	Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle	VWR	215-1594	Clean and autoclave before use
60 mm plates	Falcon	353004	Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH)	Sigma- Aldrich	338818	Liquid
Disposable scalpels	VWR	233-5526	Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Sigma- Aldrich	D6429-500ml	Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma- Aldrich	F9665-500ml	Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps	VWR	232-1317	Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin	Sigma- Aldrich	G1890-100G	Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Sigma- Aldrich	H1387-1L	Powder
Large surgical scissors	VWR	233-1211	Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors	Sigma- Aldrich	S3146	Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin	Sigma- Aldrich	P4333-100ml	Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride	Sigma- Aldrich	P9333	Powder
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma- Aldrich	P5665	Powder
Sodium Chloride	Sigma- Aldrich	S7653	Powder
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma- Aldrich	94046	Powder
Stericup Filters	Millipore	S2GPU05RE	Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes
Triton X-100	Sigma- Aldrich	9002-93-1	Liquid
Trypsin-EDTA	Sigma- Aldrich	T4049-100ml	Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes