Aislamiento inmunomagnético de células madre CD34+ residentes en la pared vascular de ratones

Resumen

Este estudio ha establecido un método estable y eficiente para el aislamiento, cultivo y determinación funcional de células madre CD34⁺ residentes en la pared vascular (CD34⁺ VW-SCs). Este método de aislamiento fácil de seguir y eficaz en el tiempo puede ser utilizado por otros investigadores para estudiar los posibles mecanismos implicados en las enfermedades cardiovasculares.

Resumen

Las células madre y progenitoras residentes en la pared vascular CD34⁺ (VW-SC) son cada vez más reconocidas por su papel crucial en la regulación y reparación de lesiones vasculares. El establecimiento de un método estable y eficiente para cultivar VW-SC CD34⁺ murinos funcionales es esencial para investigar más a fondo los mecanismos implicados en la proliferación, migración y diferenciación de estas células en diversas condiciones fisiológicas y patológicas. El método descrito combina el cribado magnético de perlas y la citometría de flujo para purificar las VW-SC residentes CD34⁺ cultivadas primarias. A continuación, las células purificadas se identifican funcionalmente mediante tinción de inmunofluorescencia e imágenes de Ca²⁺ . Brevemente, las células vasculares de la adventicia de la aorta murina y la arteria mesentérica se obtienen a través de la unión de bloques tisulares, seguida de subcultivo hasta alcanzar un recuento celular de al menos 1 × 10⁷. Posteriormente, los VW-SC CD34⁺ se purifican mediante clasificación magnética de perlas y citometría de flujo. La identificación de VW-SCs CD34⁺ implica la tinción con inmunofluorescencia celular, mientras que la multipotencia funcional se determina mediante la exposición de las células a un medio de cultivo específico para una diferenciación orientada. Además, la liberación interna funcional de Ca²⁺ y la entrada externa de Ca²⁺ se evalúan utilizando una estación de trabajo de imagen disponible en el mercado en células cargadas con Fura-2/AM expuestas a ATP, cafeína o thapsigargin (TG). Este método ofrece una técnica estable y eficiente para aislar, cultivar e identificar células madre CD34⁺ residentes en la pared vascular, lo que brinda la oportunidad de realizar estudios in vitro sobre los mecanismos reguladores de las VW-SC y el cribado de fármacos dirigidos.

Introducción

La pared vascular desempeña un papel fundamental en el desarrollo vascular, la regulación homeostática y la progresión de las enfermedades vasculares. En los últimos años, numerosos estudios han desvelado la presencia de varios linajes de células madre en las arterias. En 2004, el grupo del profesor Qingbo Xu informó por primera vez de la existencia de células madre/progenitoras vasculares en la periferia de la pared vascular adulta, que expresan CD34, Sca-1, c-kit y Flk-1¹. Estas células madre vasculares exhiben diferenciación multidireccional y potencial de proliferación. En condiciones normales, permanecen relativamente inactivos; Sin embarg....

Protocolo

Este estudio fue aprobado y los animales fueron manipulados de acuerdo con las Directrices para el Manejo y Uso de Animales de Laboratorio en China. La investigación se adhirió estrictamente a los requisitos éticos de los experimentos con animales, con la aprobación del Comité de Ética Animal (Número de aprobación: SWMU2020664). Para el presente estudio se utilizaron ratones C57BL/6 sanos de ocho semanas de edad de ambos sexos, con un peso de entre 18 y 20 g. Los animales fueron alojados en el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica del Suroeste (SWMU).

1. Cultivo de bloques tisulares de adventicia de aorta y arteri....

Discusión

Este estudio proporciona un método rápido y conveniente para obtener VW-SC CD34⁺ funcionales de la aorta y las arterias mesentéricas de ratones. Los VW-SC CD34⁺ obtenidos por este método tienen actividad proliferativa y propiedades de diferenciación multidireccional. Los receptores de trifosfato inositol 1,4,5-trifosfato (IP₃Rs), los receptores de rianodina (RyRs) y los canales de calcio almacenados median la liberación y entrada de Ca²⁺ en las VW-SC CD34⁺ . El.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% gelatin solution	Sigma	G1393
Anti-CD31 antibody	R&D	AF3628
Anti-CD34 antibody	Abcam	ab81289
Anti-c-kit antibody	CST	77522
Anti-FITC MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-FITC MicroBeads MACS	Miltenyi Biotec	130-048-701
Anti-Flk- 1 antibody	Abcam	ab24313
Anti-Ki67 antibody	CST	34330
Anti-PDGFRα antibody	Abcam	ab131591
Anti-Sca- 1 antibody	Invitrogen	710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITC	eBioscience  Invitrogen	11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APC	eBioscience  Invitrogen	17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383	Miltenyi Biotec	130-117-775
cell culture hood	JIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD	SW-CJ-2FD
Centrifuge	CENCE	L530
CO2 incubators	Thermofisher Scientific	4111
Confocal laser scanning microscope	Zeiss	zeiss 980
DMEM High Glucose Medium	ATCC	30-2002
EBM-2 culture medium	Lonza	CC-3162
FACSMelody	BD Biosciences
FACSMelody™ System	BD
Fetal bovine serum	Millipore	ES-009-C
FM-2 culture medium	ScienCell	2331
Fura-2/AM	Invitrogen	M1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Thermofisher Scientific	A32731
Leukemia inhibitory factor	Millipore	LIF2010
Microscope	Olympus	IX71
MiniMACS   Starting Kit	Miltenyi Biotec	130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B Solution	Beyotime	C0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)	BD Pharmingen	553141
Stereo Microscope	Olympus	SZX10
TILLvisION 4.0 program	T.I.L.L.Photonics GmbH	polychrome V
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)	Thermofisher Scientific	MA5-14029
β-Mercaptoethanol	Thermofisher Scientific	21985023