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Resumen

Este estudio ha establecido un método estable y eficiente para el aislamiento, cultivo y determinación funcional de células madre CD34+ residentes en la pared vascular (CD34+ VW-SCs). Este método de aislamiento fácil de seguir y eficaz en el tiempo puede ser utilizado por otros investigadores para estudiar los posibles mecanismos implicados en las enfermedades cardiovasculares.

Resumen

Las células madre y progenitoras residentes en la pared vascular CD34+ (VW-SC) son cada vez más reconocidas por su papel crucial en la regulación y reparación de lesiones vasculares. El establecimiento de un método estable y eficiente para cultivar VW-SC CD34+ murinos funcionales es esencial para investigar más a fondo los mecanismos implicados en la proliferación, migración y diferenciación de estas células en diversas condiciones fisiológicas y patológicas. El método descrito combina el cribado magnético de perlas y la citometría de flujo para purificar las VW-SC residentes CD34+ cultivadas primarias. A continuación, las células purificadas se identifican funcionalmente mediante tinción de inmunofluorescencia e imágenes de Ca2+ . Brevemente, las células vasculares de la adventicia de la aorta murina y la arteria mesentérica se obtienen a través de la unión de bloques tisulares, seguida de subcultivo hasta alcanzar un recuento celular de al menos 1 × 107. Posteriormente, los VW-SC CD34+ se purifican mediante clasificación magnética de perlas y citometría de flujo. La identificación de VW-SCs CD34+ implica la tinción con inmunofluorescencia celular, mientras que la multipotencia funcional se determina mediante la exposición de las células a un medio de cultivo específico para una diferenciación orientada. Además, la liberación interna funcional de Ca2+ y la entrada externa de Ca2+ se evalúan utilizando una estación de trabajo de imagen disponible en el mercado en células cargadas con Fura-2/AM expuestas a ATP, cafeína o thapsigargin (TG). Este método ofrece una técnica estable y eficiente para aislar, cultivar e identificar células madre CD34+ residentes en la pared vascular, lo que brinda la oportunidad de realizar estudios in vitro sobre los mecanismos reguladores de las VW-SC y el cribado de fármacos dirigidos.

Introducción

La pared vascular desempeña un papel fundamental en el desarrollo vascular, la regulación homeostática y la progresión de las enfermedades vasculares. En los últimos años, numerosos estudios han desvelado la presencia de varios linajes de células madre en las arterias. En 2004, el grupo del profesor Qingbo Xu informó por primera vez de la existencia de células madre/progenitoras vasculares en la periferia de la pared vascular adulta, que expresan CD34, Sca-1, c-kit y Flk-11. Estas células madre vasculares exhiben diferenciación multidireccional y potencial de proliferación. En condiciones normales, permanecen relativamente inactivos; Sin embargo, cuando son activados por factores específicos, pueden diferenciarse en células musculares lisas, células endoteliales y fibroblastos. Alternativamente, pueden regular la matriz perivascular y la formación de microvasos a través de efectos paracrinos para promover la reparación o remodelación de los vasos lesionados 2,3,4,5,6. Recientemente, se descubrió que las células madre CD34+ residentes en la pared vascular desempeñan un papel en la regeneración de las células endoteliales después de una lesión de la guía de la arteria femoral2. En consecuencia, el aislamiento y la cuantificación de las VW-SC CD34+ y el examen de las características biológicas básicas de las células madre CD34+ son cruciales para estudiar más a fondo las vías de señalización implicadas en la regulación de las VW-SC CD34+.

Actualmente existen varios métodos para la separación celular, incluidas las técnicas basadas en las características del cultivo celular o las propiedades físicas de las células, como la centrifugación en gradiente de densidad, que da como resultado células clasificadas que contienen muchas células no objetivo y una pureza relativamente baja 7,8,9,10,11,12 . Otra técnica comúnmente utilizada es la clasificación celular asistida por fluorescencia/magnética. La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) es un sistema complejo con altos requisitos técnicos, y es relativamente costoso, requiere mucho tiempo y potencialmente afecta la actividad de las células clasificadas13,14. Sin embargo, la clasificación por células activadas magnéticamente (MACS) es más eficiente y cómoda, con una alta tasa de recuperación y actividad de células y un menor impacto en las aplicaciones posteriores8. Por lo tanto, en este protocolo, aplicamos MACS para purificar las VW-SC CD34+ e identificamos aún más las células mediante citometría de flujo. El establecimiento de métodos de aislamiento basados en MACS para estudiar las células madre de la pared vascular sería invaluable. En primer lugar, permite estudios experimentales genéticos y de biología celular. En segundo lugar, el aislamiento y el cultivo eficientes de células madre residentes en la pared vascular permiten la evaluación sistemática y el cribado de los factores de señalización que regulan las funciones de las células madre. En tercer lugar, la identificación de fenotipos cruciales en las células madre proporciona un importante "control de calidad" para evaluar el estado de las células. Por lo tanto, la identificación de métodos para purificar podría ser útil para aplicaciones similares a las células madre análogas derivadas de vasos.

Este informe proporciona una demostración detallada de un método estable y fiable para el cultivo de VW-SC CD34+ , incluida la identificación celular y la evaluación funcional realizada mediante citometría de flujo, tinción de inmunofluorescencia y medición de señalización de Ca2+ . Este estudio proporciona una base para futuras investigaciones en profundidad sobre la función de los VW-SC CD34+ y sus mecanismos reguladores en condiciones fisiológicas y patológicas.

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Protocolo

Este estudio fue aprobado y los animales fueron manipulados de acuerdo con las Directrices para el Manejo y Uso de Animales de Laboratorio en China. La investigación se adhirió estrictamente a los requisitos éticos de los experimentos con animales, con la aprobación del Comité de Ética Animal (Número de aprobación: SWMU2020664). Para el presente estudio se utilizaron ratones C57BL/6 sanos de ocho semanas de edad de ambos sexos, con un peso de entre 18 y 20 g. Los animales fueron alojados en el Centro de Animales de Laboratorio de la Universidad Médica del Suroeste (SWMU).

1. Cultivo de bloques tisulares de adventicia de aorta y arterias mesentéricas

  1. Aislamiento de VW-SCs CD34+ residentes
    1. Anestesiar a dos ratones con inhalación de isoflurano al 3% (siguiendo protocolos aprobados institucionalmente). Confirme la anestesia adecuada con un pellizco en los dedos de los pies. Coloque el ratón en decúbito supino con cinta médica y rocíe desinfectante de etanol al 70% para desinfectar el pelaje del ratón. Abra las cavidades torácica y abdominal con tijeras y fórceps oftálmicos estériles para exponer el corazón y los intestinos. Después de diseccionar la aorta aislada y las arterias mesentéricas, fije la aorta y el lecho mesentérico en una placa de Petri que contenga elastómero de silicio y rellénela con una solución salina fisiológica. Con otro juego de tijeras y fórceps esterilizados, disecciona rápidamente la grasa alrededor de la aorta y las arterias mesentéricas.
    2. Transfiera los tejidos disecados a una placa de Petri de 6 cm que contenga una solución de penicilina-estreptomicina-anfotericina B al 1% (ver Tabla de materiales). Después de enjuagar dos veces, transfiera las arterias a una campana de cultivo de tejidos bajo un microscopio estereoscópico.
    3. Corta las arterias longitudinalmente y usa pinzas finas para despegar la capa externa de la aorta y la primera rama de las arterias mesentéricas. Transfiera las capas exteriores a una placa de Petri de 3,5 cm que contenga 0,1-0,2 mL de medio de cultivo (ver Tabla de Materiales). Corta las capas exteriores en trozos pequeños (aproximadamente 1 mm3).
    4. Transfiera las piezas de tejido a un matraz T25 recubierto de gelatina, asegurando una distribución uniforme en el fondo del matraz. Mantenga una distancia moderada entre las piezas de tejido para facilitar el rastreo y el crecimiento de las células. Coloque el matraz verticalmente en una incubadora (37 °C, 5% CO2) durante 3 h para permitir que los bloques de tejido se adhieran al fondo del matraz.
    5. Después de 3 h, agregue 5 mL de medio de crecimiento de alta glucosa DMEM para sumergir los bloques de tejido. Oriente el matraz T25 horizontalmente. Controle la migración celular alrededor de los bloques de tejido a través de un microscopio a intervalos de 3 días.
      NOTA: El medio debe contener 20% de suero fetal bovino, 0,2% de factor inhibidor de la leucemia (LIF), 0,2 mM de β-mercaptioetanol y 1% de penicilina/estreptomicina (ver Tabla de Materiales). El suero fetal bovino favorece la proliferación celular, mientras que el LIF y el β-Mercaptoetanol impiden la diferenciación celular 7,8.
    6. Cuando las células del matraz T25 alcanzan aproximadamente el 80% de confluencia, las pasa y las cultiva en uno o dos matraces T75. Subcultive las células en cinco pasajes para garantizar un crecimiento y una salud adecuados.
  2. Separación magnética de células madre CD34+ residentes
    1. Cuando las células de uno o dos matraces T75 alcancen el 80% de confluencia, disocie las células con tripsina y vuelva a suspenderlas en 1 mL de tampón de clasificación (2 mM de EDTA y 0,5% de FBS). Determine el número de celdas (matraz 107/T75) y centrifugue la suspensión de celdas a 300 x g durante 5 min (a temperatura ambiente).
    2. Deseche el sobrenadante por completo y vuelva a suspender el pellet de células en 98 μL de tampón de clasificación por cada 107 células totales. Añadir 2 μL de anticuerpo CD34 (ver Tabla de Materiales). Mezclar bien e incubar durante 30 min a 4°C en la oscuridad con sacudidas ocasionales.
    3. Lave las celdas añadiendo 2 mL de tampón de clasificación y centrifugar a 300 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
    4. Retire el sobrenadante con cuidado y por completo, y vuelva a suspender las células en 80 μL de tampón de clasificación.
    5. Agregue 20 μL de MicroBeads Anti-FITC (por 107 celdas en total, consulte la Tabla de materiales) en el tampón. Mezclar bien mediante pipeteo repetitivo e incubar durante 15 min a 4 °C en la oscuridad con agitación intermitente.
    6. Lave las células dos veces añadiendo 2 ml de tampón y centrifugue a 300 x g durante 5 min para repeler las células. Deseche el sobrenadante por completo y vuelva a suspender las células en 1 mL de tampón.
    7. Coloque una columna MS dentro del campo magnético de un separador apropiado, asegurándose de que se coloque un tubo colector (por ejemplo, un tubo centrífugo de 15 mL) debajo de la columna MS para recoger los componentes separados. (ver Tabla de Materiales). Enjuague la columna con tampón de 500 μL y espere hasta que se haya agotado por completo.
    8. Cargue la suspensión de celdas en la columna y recoja el flujo que contiene celdas sin etiquetar en el tubo de 15 ml.
    9. Retire la columna del separador y colóquela en un nuevo tubo de centrífuga de 15 ml. Introduzca 500 μL de tampón en la columna y, a continuación, elimine rápidamente las células marcadas magnéticamente empujando el émbolo hacia el interior de la columna.
    10. Para mejorar la pureza de las células CD34+ , la fracción eluida puede someterse a un enriquecimiento utilizando una segunda columna de MS. Repita el proceso de separación como se mencionó anteriormente. Evalúe la pureza de las células clasificadas mediante citometría de flujo.
      NOTA: Por lo general, se obtienen entre un 10% y un 20% de células CD34+ , con alrededor de un 70%-80% de células negativas y aproximadamente un 10% de pérdida debido a los procedimientos de tinción y centrifugación.
    11. Para confirmar aún más la pureza de las células madre CD34+ de la pared vascular, identifique las células clasificadas mediante citometría de flujo. El presente estudio mostró una pureza de más del 90%.

2. Identificación celular por inmunofluorescencia

  1. Células de semilla en cubreobjetos (diámetro 8 mm) pre-recubiertos con 0,04% de gelatina.
  2. Cuando las células alcancen aproximadamente el 60%-70% de confluencia, enjuague dos veces con PBS y fije las células con paraformaldehído al 4% durante 10 minutos.
  3. Lave las células con PBS durante 3 min (3 veces) y permeabilice las celdas con Triton X-100 al 0,2% (en PBS) durante 5 min a temperatura ambiente.
  4. Lavar las células con PBS durante 3 min (3 veces) y bloquear la unión inespecífica de los anticuerpos con suero de burro al 5% (en PBS) durante 1 h.
  5. Retire el tampón de bloqueo sosteniendo cada cubreobjetos en su borde con pinzas y escurriéndolo sobre una hoja de toallita sin pelusa.
  6. Incubar las células en anticuerpos primarios diluidos 100 veces (CD34, Flk-1, c-kit, Sca-1, Ki67, ver Tabla de Materiales) en BSA al 1% (en PBS) durante la noche a 4 °C.
  7. Decantar la solución y lavar las células con PBS durante 3 min (3 veces). Incubar las células con el anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor 488 (1:200 en BSA al 1%) (ver Tabla de Materiales) durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad.
  8. Realice la contratinción de DAPI diluyendo la solución madre de DAPI a 0,5 μg/ml en PBS y células de incubación durante 5 min.
  9. Enjuague con PBS y selle los cubreobjetos con reactivo antidecoloración. Capture imágenes bajo el microscopio confocal de escaneo láser.

3. Diferenciación y caracterización inducida de VW-SCs CD34+

  1. Siembre células madre CD34+ a una densidad adecuada (40%-50% de confluencia) en cubreobjetos y placas de 6 pocillos, respectivamente.
  2. Inducir la diferenciación orientada a las células endoteliales a partir de células CD34+ mediante el cultivo de células en medio de cultivo de células endoteliales EBM-2 (ver Tabla de Materiales) durante 1 semana.
  3. Inducir la diferenciación orientada a las células de fibroblastos a partir de las células CD34+ mediante el cultivo de células en el medio de cultivo de células de fibroblastos FM-2 (ver Tabla de Materiales) durante 3 días.
  4. Sométase las células indiferenciadas y diferenciadas a una tinción de inmunofluorescencia (como se mencionó en el paso 2) con una excitación láser de 488 nm y un objetivo de 40x. Detectar la expresión de marcadores de células endoteliales (CD31, VWF) y marcadores de células de fibroblastos (PDGFRα, Vimentina) (ver Tabla de Materiales).
  5. Disociar las células con tripsina y obtener el pellet celular por centrifugación (300 x g, 5 min, temperatura ambiente). Vuelva a suspender las células con 100 μL de tampón de clasificación. Preincubar la suspensión celular con CD16/CD32 mAb anti-ratón purificado (1 μg) (ver Tabla de Materiales) a 4 °C durante 5 min.
  6. Añadir 2 μL de PE Rat anti-Mouse CD34 (1:50), CD31 (PECAM-1) Anticuerpo monoclonal APC (2 μL, 1:50) y CD140a (PDGFRa) Anticuerpo monoclonal FITC (2 μL, 1:50) directamente a las células preincubadas en presencia de Mouse Fc Block e incubar a 4 °C durante 15 min.
  7. Lave las células dos veces añadiendo 2 ml de tampón y centrifugue a 300 x g durante 5 min (temperatura ambiente) para repeler las células. Deseche el sobrenadante por completo y vuelva a suspender las células en 300 μL de tampón. Coloque los tubos de flujo con células teñidas en una nevera lista para la citometría de flujo.

4. Detección de señalización intracelular de Ca2+ en células madre vasculares CD34+

  1. Células de siembra en cubreobjetos 10 h antes de los experimentos a una densidad de hasta el 70% de confluencia.
  2. Saca los cubreobjetos y pégalos al fondo de una cámara personalizada con cualquier vaselina.
  3. Lave los cubreobjetos una vez con PBS, reemplácelos con Fura-2/AM (5 μM) en la solución de Tyrode (NaCl 137 mM, KCl 5.4 mM, MgCl2 1.2 mM, glucosa 10 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 2.4 mM) (ver Tabla de Materiales), e incube las células durante 30 min en la oscuridad.
  4. Retire el tinte tratándolo con la solución de Tyrode durante 10 minutos para permitir la desesterificación de fura-2/AM.
  5. Monte la cámara en la platina de un microscopio de fluorescencia invertida equipado con un sistema de imágenes de campo amplio que contiene un monocromador y una cámara CCD (ver Tabla de Materiales).
  6. Abra la ventana principal, vaya al cuadro de diálogo Configuración de agarre y a la página de la cámara, y presione el botón en vivo para la visualización de imágenes en vivo.
  7. Elija el tipo de imagen de fluorescencia, configure los tiempos de repetición del bucle de 340 nm/380 nm, el tamaño de la imagen y el tiempo de exposición de la cámara en 380 nm y 340 nm para lograr un brillo de imagen óptimo.
  8. Tome instantáneas individuales y dibuje varias líneas a mano alzada para rodear las celdas con diferentes colores y predefinir la región de intereses (ROI), indicando el fondo como ROI 0.
  9. Vuelva a editar un protocolo ya incrustado en la vista del espacio de trabajo y cree un nuevo espacio de trabajo.
  10. Ejecute el protocolo y la "Fluorescencia 340 nm div Fluorescencia 380 nm (cinética en vivo)" mostrará el gráfico cinético en línea.
  11. En la vista numérica, se verá una hoja de cálculo que presenta columnas de valores en escala de grises y la información de tiempo correspondiente. Exporte los datos de la hoja de cálculo mediante el portapapeles.
  12. Calcule F340 nm/F380 nm que indica cambios intracelulares de Ca2+ después de restar la fluorescencia de fondo (ROI 0).

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Resultados

Aislamiento y purificación de CD34+ VW-SC
La alta pureza de los VW-SC CD34+ se obtiene de la adventicia de la arteria aórtica y mesentérica del ratón mediante la unión de tejidos y la clasificación magnética de microperlas. El porcentaje de células CD34+ en la pared de los vasos es generalmente del 10% al 30%. La citometría de flujo confirma que la pureza de las células CD34+ obtenidas por clasificación magnética de perlas es superior al 90% (

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Discusión

Este estudio proporciona un método rápido y conveniente para obtener VW-SC CD34+ funcionales de la aorta y las arterias mesentéricas de ratones. Los VW-SC CD34+ obtenidos por este método tienen actividad proliferativa y propiedades de diferenciación multidireccional. Los receptores de trifosfato inositol 1,4,5-trifosfato (IP3Rs), los receptores de rianodina (RyRs) y los canales de calcio almacenados median la liberación y entrada de Ca2+ en las VW-SC CD34+ . El...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82070502, 31972909, 32171099), el Programa de Ciencia y Tecnología de Sichuan de la Provincia de Sichuan (23NSFSC0576, 2022YFS0607). Los autores desean agradecer a Qingbo Xu de la Universidad de Zhejiang por su ayuda con el cultivo celular, y los autores reconocen la asistencia científica y técnica de la plataforma de citometría de flujo en la Universidad Médica del Sudoeste.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
2% gelatin solutionSigmaG1393
Anti-CD31 antibodyR&DAF3628
Anti-CD34 antibodyAbcamab81289
Anti-c-kit antibodyCST77522
Anti-FITC MicroBeadsMiltenyi Biotec130-048-701 
Anti-FITC MicroBeads MACSMiltenyi Biotec130-048-701
Anti-Flk- 1 antibodyAbcamab24313
Anti-Ki67 antibodyCST34330
Anti-PDGFRα antibodyAbcamab131591
Anti-Sca- 1 antibodyInvitrogen710952
CD140a (PDGFRA) Monoclonal Antibody (APA5), FITCeBioscience  Invitrogen11-1401-82
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), APCeBioscience  Invitrogen17-0311-82
CD34 Antibody, anti-mouse, FITC, REAfinity Clone REA383Miltenyi Biotec130-117-775
cell culture hoodJIANGSU SUJING GROUP CO.,LTD SW-CJ-2FD
Centrifuge  CENCE  L530
CO2 incubators            Thermofisher Scientific4111
Confocal laser scanning microscope Zeiss zeiss 980  
DMEM High Glucose MediumATCC30-2002
EBM-2 culture mediumLonzaCC-3162
FACSMelody  BD Biosciences
FACSMelody™ System BD
Fetal bovine serumMilliporeES-009-C
FM-2 culture mediumScienCell2331
Fura-2/AM InvitrogenM1292
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 Thermofisher Scientific   A32731
Leukemia inhibitory factorMilliporeLIF2010
Microscope OlympusIX71
MiniMACS   Starting KitMiltenyi Biotec130-090-312
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin B SolutionBeyotimeC0224
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block)BD Pharmingen553141
Stereo Microscope OlympusSZX10 
TILLvisION 4.0 program  T.I.L.L.Photonics GmbHpolychrome V 
VWF Monoclonal Antibody (F8/86)Thermofisher Scientific MA5-14029
β-MercaptoethanolThermofisher Scientific21985023

Referencias

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