Monitorización de la glucosa en sangre en crías de ratón después de la inyección intracitoplasmática de espermatozoides

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para establecer un modelo de ratón de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) y transferencia de embriones (ET), lo que nos permite observar cambios relacionados con la edad en el metabolismo de la glucosa que pueden atribuirse a ICSI, proporcionando información sobre sus posibles impactos a largo plazo en el desarrollo humano.

Resumen

La esperanza de vida humana es considerablemente larga, mientras que los modelos de ratón pueden simular toda la vida humana en un período relativamente corto, con un año de vida del ratón aproximadamente equivalente a 40 años humanos. La inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) es una tecnología de reproducción asistida comúnmente utilizada en la práctica clínica. Sin embargo, dada su aparición relativamente reciente hace unos 30 años, los efectos a largo plazo de esta técnica en el desarrollo humano siguen sin estar claros. En este estudio, establecimos el método ICSI combinado con el método de transferencia embrionaria (ET) utilizando un modelo de ratón. Los resultados demostraron que los espermatozoides normales de ratón, después de someterse a un cultivo in vitro y a una ICSI posterior, mostraron una tasa de fertilización del 89,57% y una tasa de dos células del 87,38%. Después de la ET, la tasa de natalidad de la descendencia fue de aproximadamente el 42,50%. Además, a medida que los ratones envejecían, se observaron fluctuaciones en los niveles de metabolismo de la glucosa, que pueden estar asociadas con la aplicación de la técnica ICSI. Estos hallazgos significan que la técnica ICSI-ET de ratón proporciona una plataforma valiosa para evaluar el impacto de las anomalías de los espermatozoides en el desarrollo embrionario y sus efectos a largo plazo en la salud de la descendencia, particularmente en lo que respecta al metabolismo de la glucosa. Este estudio proporciona información importante para futuras investigaciones sobre los efectos potenciales de la técnica ICSI en el desarrollo humano, haciendo hincapié en la necesidad de una investigación en profundidad sobre las implicaciones a largo plazo de esta tecnología.

Introducción

Las cuestiones de fecundidad se han convertido en uno de los principales focos de preocupación médica y sociológica, especialmente en la sociedad moderna, donde la disminución de las tasas de fecundidad y la creciente gravedad de la prevalencia y gravedad de la infertilidad han cobrado importancia. La tecnología de reproducción asistida (TRA) ofrece una amplia gama de posibilidades para abordar estos desafíos, con la inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) comúnmente utilizada como intervención terapéutica.

Desde que Palermo reportó el primer embarazo exitoso logrado a través de la Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides (ICSI) en 1992, la ICSI se ha convertido en una técnica fundamental en las Tecnologías de Reproducción Asistida (TRA)¹. Sin embargo, teniendo en cuenta que la ICSI se ha utilizado en entornos clínicos durante solo 30 años, un período relativamente breve en comparación con la esperanza de vida humana, los efectos a largo plazo de la ICSI, especialmente en el desarrollo de la descendencia, no se han investigado ni dilucidado ampliamente. En la actualidad, los ratones, caracterizados por su origen genético uniforme y su menor esperanza de vida, han surgido como un modelo alternativo ampliamente utilizado en la investigación médica. Además, el modelo de ratón puede recapitular toda la vida humana dentro de un marco de tiempo comprimido, donde un año en ratones corresponde aproximadamente a 40 años en humanos².

Durante la última década, varios estudios a pequeña escala han informado que las personas concebidas a través de ICSI pueden tener un mayor riesgo de desarrollar síndromes metabólicos, como niveles anormales de azúcar en la sangre, más adelante en la vida ^3,4. Aunque la evidencia no es definitiva, este hallazgo ha suscitado serias preocupaciones dentro de la comunidad científica con respecto a las implicaciones a largo plazo para la salud de la ICSI. Esta situación pone de relieve la necesidad apremiante de realizar evaluaciones más rigurosas de la terapia antirretroviral y de sus consecuencias para la salud a largo plazo. Particularmente a la luz de las limitaciones y consideraciones éticas de los estudios en humanos, el desarrollo de modelos animales que puedan recapitular con precisión el desarrollo de la descendencia humana después de la ICSI se ha vuelto cada vez más crucial. En este contexto, el modelo de ratón ICSI-ET (Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides-Transferencia de Embriones), debido a su capacidad para imitar el ICSI humano y facilitar el seguimiento a largo plazo de los resultados de salud de la descendencia, se ha convertido en una herramienta eficaz para evaluar los riesgos potenciales para la salud de la tecnología ICSI en la descendencia⁵.

Este estudio tiene como objetivo investigar el impacto de la tecnología ICSI-ET en un fenotipo metabólico prevalente, a saber, la salud metabólica de la glucosa en la descendencia, mediante el empleo de monitoreo aleatorio de glucosa en sangre, pruebas de glucosa en sangre en ayunas y pruebas de tolerancia a la glucosa para evaluar el estado metabólico de la glucosa de ratones. El monitoreo aleatorio de la glucosa en sangre se utiliza para capturar las fluctuaciones naturales en el metabolismo de la glucosa durante las actividades fisiológicas normales, mientras que las pruebas de glucosa en sangre en ayunas y tolerancia a la glucosa se emplean para evaluar posibles estados prediabéticos.

Protocolo

El protocolo de ICSI-ET que se describe a continuación sigue las pautas y ha sido aprobado por la investigación Animal Ethical Review del Instituto de Planificación Familiar de Shanghai. Procedimientos de seguridad: Siempre use equipo de protección personal (EPP) adecuado cuando manipule productos químicos o materiales biológicos. Uso de campanas: Realice todos los procedimientos que involucren productos químicos volátiles o generación de aerosoles dentro de una campana extractora certificada o un gabinete de bioseguridad. Utilice ratones hembra (cepa B6D2F1 de 6-8 semanas de edad) para el procedimiento de superovulación.

1. ICSI en ratones

1. Superovulación de ratones
   1. Administrar una inyección intraperitoneal de gonadotropina sérica de yegua preñada (PMSG) a una dosis de 7,5 UI por ratón alrededor de las 20:00 del primer día.
   2. Administrar una inyección intraperitoneal de gonadotropina coriónica humana (HCG) a una dosis de 7,5 UI por ratón alrededor de las 20:00 (48 horas después de la inyección de PMSG) al tercer día.
2. Prepare el medio HTF en alícuotas de 1 mL y déjelas al descubierto para su equilibrio durante la noche a 37 °C en una incubadora de CO₂ al 5% el mismo día de la inyección de HCG en ratones hembra.
3. Preparación de gotitas de fertilización ICSI
   1. El mismo día de la inyección de HCG en ratones hembra, divida la tapa de una placa de cultivo celular de 50 x 9 mm en mitades superior e inferior. Use la mitad superior para crear 4-6 gotas de 5 μL cada una, usando un 10% de polivinilpirrolidona (PVP) para la colocación de espermatozoides. Utilice la mitad inferior para crear de 8 a 10 gotas de 5 μL cada una, utilizando medio M2 para el procedimiento ICSI.
   2. Cubra las gotas medianas PVP y M2 con aproximadamente 3 mL de aceite mineral (Figura 1).
4. Elaboración de platos de cultivo
   1. El mismo día de la inyección de HCG en ratones hembra, dispensar 12 gotas de medio KSOM (MR-020P-D) de 20 μL de manera uniforme en una placa de cultivo celular de 35 x 10 mm. Cubre las gotas con aproximadamente 3 mL de aceite mineral.
5. Recolección de espermatozoides:
   1. Eutanasia de ratones machos por luxación cervical aproximadamente a las 9:00 a.m. del cuarto día (13 h después de la inyección de HCG).
   2. Aísle la cola del epidídimo y límpiela a fondo para eliminar cualquier tejido adiposo y restos de sangre secando suavemente con gasa estéril y enjuagando con un medio HTF precalentado.
   3. Abra la cola del epidídimo para permitir que los espermatozoides naden libremente hacia el medio HTF. Exprima suavemente la cola con pinzas para liberar los espermatozoides, recójalos en tubos HTF preequilibrados y manténgalos descubiertos en una incubadora de 37 °C con 5% de CO₂ para la capacitación de los espermatozoides para su uso posterior.
6. Extracción de ovocitos
   1. Eutanasia de ratones hembra estimulados para la recuperación de ovocitos por luxación cervical alrededor de las 9:30 a.m. del cuarto día. Haga una incisión con cuidado a lo largo de la línea media de la piel abdominal y la capa muscular para exponer la cavidad abdominal.
   2. Use pinzas finas para aislar suavemente el tejido de ambos lados de los oviductos, especialmente las regiones de ampollas inflamadas, y transfiéralo al medio M2 en una placa de cultivo esterilizada. Repita este procedimiento hasta que se recojan los oviductos de todos los ratones designados.
   3. Bajo un microscopio de disección, utilice una aguja de jeringa de 1 mL para perforar suavemente la sección transparente de la ampolla hinchada del oviducto, facilitando la liberación de complejos cúmulo-ovocito (COC) en el medio.
   4. Con la misma jeringa, recoja y transfiera con cuidado los AOC a una nueva placa que contenga 100 μL de medio M2 fresco. Repita este paso hasta que todos los AOC se transfieran con éxito desde los segmentos de oviducto originales.
   5. Limpie la sangre y los fluidos tisulares y, bajo un microscopio de disección, abra la ampolla del oviducto con una aguja de 25 G, lo que resulta en la liberación de numerosos AOC.
   6. Retire el oviducto y los fragmentos de tejido, transfiera los AOC a gotas de medio M2 que contenga hialuronidasa (HY) y precaliéntelos a 37 °C.
   7. Después de la incubación durante aproximadamente 5 min, realice un pipeteo suave para facilitar la separación de las células del cúmulo y los ovocitos. Transfiera los ovocitos de la metafase II (MII) de la solución que contiene HY a un medio M2 fresco; luego, realice la transferencia secuencial en múltiples gotas de medio M2.
   8. Después de 2-3 rondas de lavados, transfiera los ovocitos a gotitas de medio de cultivo KSOM y manténgalos en una incubadora a 37 °C, 5% de CO₂ para su uso posterior.
7. Alrededor de las 10:00 a.m. del cuarto día, sonique 100 μL de los espermatozoides capacitados (ver paso 1.5.2.) durante 5 s para separar las cabezas de las colas a una frecuencia de 46 kHz, con un ajuste de potencia de 50 vatios.
   NOTA: Al sonicar esperma para truncar la cola, tenga cuidado de controlar el tiempo, que no debe exceder los 5 s. Unos segundos después de la sonicación, los espermatozoides pueden observarse bajo un microscopio invertido; Deja de sonicar cuando aproximadamente la mitad de los espermatozoides muestran colas truncadas.
8. Procedimiento ICSI
   1. Para la inyección, utilice una aguja de micromanipulación disponible en el mercado con una punta plana y un diámetro interior de 6 μm, colocada en un ángulo de 25°. Llene la aguja con el líquido quirúrgico con la porción llena que mida una longitud de 0,5 cm dentro de la aguja. Asegúrese de que el nivel del líquido alcance ~0,5 cm.
      NOTA: Mantener la temperatura ambiente a 19 °C durante la inyección para evitar altas temperaturas que puedan reducir la tasa de supervivencia de los ovocitos fecundados. La precisión para garantizar que el nivel de líquido alcance los 0,5 cm es crucial para mantener la integridad del proceso de inyección y garantizar la viabilidad de los ovocitos.
   2. Instale la aguja de inyección en el brazo derecho del micromanipulador, fijada de forma segura apretando la tapa de sujeción. Instale una pipeta de sujeción de micromanipulación de punta plana disponible en el mercado diseñada para ovocitos de ratón en el brazo izquierdo del micromanipulador, y coloque la aguja de inyección y la pipeta de sujeción en el campo de visión del microscopio.
   3. Añadir 1 μL de esperma sonicado a una gota de solución de PVP con una pipeta.
   4. Colocar 20 ovocitos MII en una gotita de medio M2.
   5. Utilice la aguja de inyección para aspirar de 10 a 20 cabezas de esperma en una solución PVP. A continuación, introduzca la aguja de inyección en la gota que contiene los ovocitos.
   6. Determine directamente la posición del huso de la metafase dentro del ovocito bajo un microscopio de polarización para asegurarse de que el aparato del huso no esté en el lado de la inyección, con el cuerpo polar típicamente ubicado en la posición de las 12 en punto o las 6 en punto en relación con la orientación del ovocito.
   7. Mantenga el ovocito en contacto con el fondo de la placa de cultivo. Ajustar el plano focal para que la zona pelúcida del ovocito y la aguja de inyección estén en el mismo plano.
   8. Al entrar en contacto de la aguja de inyección con la zona pelúcida, aplique una ligera presión negativa a la aguja de inyección, extrayendo una parte de la zona pelúcida.
   9. Activa simultáneamente pulsos piezoeléctricos con un ajuste de intensidad de 5 y una frecuencia de 1, creando efectivamente una perforación en la zona pelúcida y permitiendo el paso de la aguja de inyección.
   10. Haga avanzar la aguja de inyección en el espacio perivitelino, empujando la cabeza del espermatozoide hacia la punta de la aguja. Inserte la aguja de inyección en el ovocito hasta que llegue al lado opuesto de la zona pelúcida.
   11. Utilice pulsos piezoeléctricos ajustados a una intensidad de 1 y una frecuencia de 1 para crear un pequeño poro en la membrana plasmática, asegurando que la cabeza del espermatozoide se inyecte en el ooplasma con una entrada mínima de PVP y una preservación óptima de la integridad del ovocito.
   12. Repetir el paso 1.8.11 hasta inyectar los 20 ovocitos, seguido de una incubación de 15 min a 19 °C.
   13. Transfiera los ovocitos supervivientes al medio KSOM y colóquelos en la incubadora. Observe las tasas de formación de 2 células, 4 células, mórulas y blastocistos.
       NOTA: Se debe controlar el momento de la inyección intracitoplasmática de un solo espermatozoide (ICSI) en el ovocito, con el objetivo de completar el procedimiento dentro de las 14-18 horas posteriores a la inyección de HCG.

2. Trasplante uterino de blastocistos de ratón

1. Preparación de ratones machos vasectomizados
   NOTA: Utilice ratones machos ICR de 6 a 8 semanas de edad para el estudio.
   1. Inducir la anestesia mediante inyección intraperitoneal de 2,2,2,2-tribromoetanol al 1,25% a una dosis de 0,2 mL/10 g de peso corporal. La ausencia de cualquier respuesta al dolor indica un éxito de la anestesia.
      NOTA: Si bien el protocolo actual no incluye la aplicación de ungüento veterinario en los ojos de los animales anestesiados, se recomienda como una mejor práctica para prevenir la sequedad ocular y garantizar la salud y la comodidad de los animales durante los procedimientos. A lo largo del proceso quirúrgico y de recuperación, todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizaron antes de su uso, y el área quirúrgica se preparó con soluciones antisépticas para garantizar un entorno quirúrgico limpio.
   2. Para protegerse contra posibles tensiones o lesiones, aloje a los ratones que se han sometido a la cirugía individualmente durante la fase inicial de recuperación.
   3. Administrar buprenorfina a una dosis de 0,05 mg/kg de peso corporal para garantizar un alivio óptimo del dolor.
      NOTA: Para garantizar el bienestar de los ratones, vigile de cerca a los ratones durante el período de recuperación y no los deje desatendidos hasta que recuperen la conciencia suficiente para mantener el decúbito esternal.
   4. Preparar el sitio quirúrgico en la región abdominal inferior, superior a los testículos. Retirar el pelaje y desinfectar con povidona yodada. Con unas tijeras estériles, haga una incisión longitudinal de 1 cm a lo largo de la línea alba. Retire suavemente la sangre con papel estéril y libre de polvo y proceda a diseccionar sin rodeos los músculos abdominales a lo largo de la línea alba y acceder a la cavidad abdominal.
   5. Con pinzas curvas, agarre y exponga suavemente el testículo izquierdo y su almohadilla de grasa asociada. Identifique el conducto deferente y aíslelo cuidadosamente con pinzas puntiagudas, creando un segmento de 10 mm para su manipulación.
   6. Esterilice las pinzas curvas sosteniéndolas en la llama exterior de una lámpara de alcohol durante varios segundos. Agarre suavemente el conducto deferente, haciendo que se aplane y blanquee debido a la cauterización. Cree un segundo punto de cauterización de 3-5 mm distal al primero. Con unas tijeras quirúrgicas estériles, extirpe el segmento de los conductos deferentes entre los dos puntos de cauterización.
   7. Inspeccione cuidadosamente los extremos cauterizados de los conductos deferentes, asegurándose de que quede un segmento corto, aplanado y blanqueado. Con pinzas curvas, regrese suavemente el testículo y su almohadilla de grasa asociada a la cavidad abdominal.
   8. Repita el procedimiento descrito en el paso 2.1.6 en el lado contralateral (derecho).
   9. Cierre el sitio quirúrgico con suturas, generalmente colocando un punto en la capa muscular y tres puntos en la piel. Asegurar la correcta alineación de la incisión quirúrgica y desinfectar con povidona yodada. Transfiera al animal a una almohadilla térmica para su observación, monitoreando durante 10-15 minutos hasta que el animal recupere la conciencia. Una vez recuperado, devuelva el animal a su jaula de alojamiento.
      NOTA: Después de la cirugía de vasectomía, los ratones requieren un período de recuperación de 14 días, seguido de un experimento de apareamiento de prueba de 1 semana.
   10. Durante esta semana, aparear continuamente a los machos vasectomizados con las hembras y observar el estado de embarazo de todas las hembras que presenten tapones copulatorios. El apareamiento exitoso está indicado por la presencia de un tapón vaginal en bloque de color blanco amarillento en el orificio vaginal de la hembra de ratón.
       1. Empareje a los ratones entre las 4:00 p.m. y las 6:00 p.m. el primer día y revise los tapones vaginales entre las 7:00 a.m. y las 9:00 a.m. el segundo día. Considere que las hembras con tapones vaginales están en un estado de pseudoembarazo a los 0,5 días y utilícelos para experimentos posteriores de transferencia de embriones. Devuelva las hembras sin tapones vaginales al grupo receptor.
          NOTA: Estas hembras sin tapones vaginales pueden seguir siendo utilizadas para el apareamiento y preparar a las hembras pseudopreñadas. Asegurarse de que todas las hembras taponadas no queden embarazadas; Solo entonces se puede utilizar a los machos vasectomizados para experimentos formales.
       2. Si bien los machos vasectomizados pueden aparearse a diario, permita 1 día de descanso entre las sesiones de apareamiento.
          NOTA: Según nuestra experiencia, los hombres vasectomizados pueden mantener una alta tasa de tapón copulatorio durante más de un año. Sin embargo, los machos vasectomizados que no logran producir tapones copulatorios en las hembras en apareamiento durante 4-6 intentos consecutivos deben ser retirados del estudio.
2. Preparación de hembras pseudopreñadas
   1. Genere ratones hembra pseudopreñados mediante el apareamiento de ratones hembra ICR (de 7 a 10 semanas, con un peso superior a 25 g) con ratones machos vasectomizados (de 3 a 6 meses de edad) en una proporción de 1:1.
      NOTA: Los machos vasectomizados se utilizaron para estimular el cuello uterino de los ratones hembra, lo que resultó en la activación de los cuerpos lúteos.
3. Preparación de la pipeta para la transferencia de blastocistos
   1. Sacar los embriones a trasplantar de la incubadora y transferirlos a una gota de medio M2 a una temperatura de 37 °C.
   2. Utilice una pipeta de transferencia para aspirar un pequeño volumen de líquido, aspirar una pequeña cantidad de aire y aspirar de 6 a 10 embriones. Por último, aspire otro pequeño volumen de aire para sellar la pipeta.
      NOTA: La longitud del fluido en la pipeta de transferencia no debe exceder los 0,5 cm.
4. Trasplante uterino (blastocistos)
   1. Pesar a los ratones hembra pseudopreñados (2,5 días después del apareamiento) y anestesiarlos mediante inyección intraperitoneal de 2,2,2,2-tribromoetanol al 1,25% a una dosis de 0,2 mL/10 g de peso corporal. Presione suavemente la oreja con pinzas.
   2. Después de administrar la anestesia a los ratones y asegurar la asepsia a través de la desinfección con alcohol, realice una incisión longitudinal en la línea media del abdomen ventral. Aprovechando el tejido subcutáneo suelto, desplace la incisión hacia el lado izquierdo o derecho, según sea necesario para el trasplante. Utilice unas tijeras pequeñas para realizar una disección roma de la capa muscular de la pared abdominal a ~0,5 cm lateral de la columna lumbar para acceder a la cavidad peritoneal.
   3. Con pinzas atraumáticas, exteriorice cuidadosamente los ovarios, los oviductos y el útero.
   4. Con la punta de una aguja de jeringa, haga una pequeña incisión en ángulo ascendente en la pared uterina por debajo de la unión útero-tubárica, evitando los vasos sanguíneos. Esta incisión proporciona acceso a la cavidad uterina; Inserte suavemente el oviducto 2-3 mm a través del orificio pequeño.
   5. Expulse con cuidado la pequeña burbuja de aire al final de la pipeta de transferencia mientras observa atentamente la pipeta de transferencia durante la inyección lenta de los embriones. Una vez que se haya confirmado la expulsión de la parte central del medio de cultivo, detenga el procedimiento y retire suavemente la pipeta de transferencia.
   6. Reposicione los ovarios, los oviductos y el útero de nuevo en la cavidad abdominal. Sutura la capa muscular y la piel por separado. Coloque a los ratones en una almohadilla térmica hasta que se recuperen de la anestesia. Para garantizar el bienestar de los ratones, vigile de cerca a los ratones durante el período de recuperación y no los deje desatendidos hasta que recuperen la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal.
5. Observación del embarazo
   1. Después de la cirugía, observe a los ratones durante 18-21 días para controlar el número de crías nacidas. En caso de distocia (parto difícil), realizar una cesárea. Permitir que los ratones recién nacidos sean acogidos por madres lactantes del mismo grupo de edad.

3. Prueba aleatoria de glucosa en sangre, glucosa en sangre en ayunas y tolerancia a la glucosa

1. Seguimiento aleatorio de los niveles de glucosa en sangre durante el crecimiento del ratón
   1. Desde el nacimiento de los ratones, controle el nivel aleatorio de glucosa en sangre cada 4 semanas a las 9 am después de una buena noche de alimentación y diversión.
      1. Perfora la punta de la cola del ratón para obtener sangre de las venas de la cola.
      2. La primera gota de sangre tiene un valor de medición de azúcar más alto debido a la presencia del líquido tisular mezclado con ella. Por lo tanto, limpie suavemente la primera gota de sangre con papel absorbente limpio.
      3. Mida la glucosa en sangre de la segunda gota (~4 μL) de la vena de cola con un glucómetro de mano.
2. Seguimiento de los cambios en la glucosa en sangre en ayunas y la tolerancia a la glucosa durante el desarrollo de los ratones
   NOTA: Teniendo en cuenta que el primer punto de tiempo de muestreo de sangre es de 15 minutos, todos los ratones deben inyectarse dentro de los 15 minutos. Dado que cada inyección de ratón tardó entre 20 y 30 segundos, para garantizar que las inyecciones se completen dentro de este período de tiempo, el número máximo de ratones que se pueden utilizar en cada prueba no puede superar los 30.
   1. Realice las pruebas de glucosa en sangre en ayunas y tolerancia a la glucosa cada 4 semanas después del nacimiento en ratones que ayunan durante la noche.
      1. El primer día, prepare ropa de cama de virutas frescas irradiadas, jaulas limpias, tapas y botellas de agua. Transfiera los ratones a una jaula nueva sin comida. Agregue etiquetas de no alimentación a las jaulas.
      2. Prepare suficiente inyección de glucosa al 10% (estéril y sin pirógenos) y jeringas de 1 mL.
      3. Asegúrese de que los ratones de cada grupo ayunen durante 16 h, desde las 17:00 horas del día 1 hasta las 9:00 horas del día 2, pero permita el libre acceso al agua. Mida los niveles de glucosa en sangre en ayunas como se describe en los pasos 3.1.1.1-3.1.1.3 usando un medidor de glucosa.
   2. Pesa a los ratones y marca sus colas para facilitar una rápida identificación. Prepare jeringas de glucosa con 10 μL/g de peso de ratón.
   3. A intervalos de 30 s, inyectar 10 μL/g de glucosa en la cavidad intraperitoneal del ratón.
      NOTA: Se debe prestar especial atención a las técnicas de inyección aquí para evitar un volumen de inyección de líquido inexacto. Los puntos clave de operación son los siguientes:
      1. Inmoviliza al ratón y sujeta la cola con una mano. Mantenga la cabeza ligeramente más baja que los glúteos para que los órganos de la cavidad abdominal se desplacen hacia la cabeza, dejando suficiente espacio para la inyección.
      2. Coloque la aguja entre la línea media y el hueso de la cadera, insértela a través de la piel en un ángulo de 45 grados, luego guíe suavemente la aguja más profundamente en la cavidad abdominal mientras la mantiene alineada paralela a la superficie de la piel durante ~ 0,5 cm.
         NOTA: Preste atención a cualquier resistencia durante la inyección para determinar si los órganos internos se perforan accidentalmente.
      3. Expulse la jeringa en la cavidad abdominal.
      4. Registre la hora en que comenzó la inyección y use un temporizador para controlar la velocidad de inyección. Configure el temporizador a 90 segundos para tres ratones para evitar perder tiempo en el manejo del temporizador.
   4. Tome la medición de glucosa en sangre de la vena de cola a los intervalos deseados (0 antes de la administración de glucosa, 15, 30, 60, 90 y 120 min después de la carga de glucosa).
      NOTA: Las pruebas posteriores de glucosa en sangre también deben tomar 20-30 s para cada ratón.
   5. Regrese a los ratones a sus jaulas domésticas equipadas con comida y agua después del experimento.

Resultados

En nuestro laboratorio, hemos conseguido una tasa de fecundación del 89,57% y una tasa de 2 células del 87,38% utilizando ICSI con espermatozoides caudales del epidídimo en ratones. La tasa de natalidad de las crías después de la ET es de aproximadamente el 42,50%. Sorprendentemente, todas las tasas de fertilización, las tasas de 2 células y las tasas de nacimiento de descendientes son comparables a los niveles alcanzados en la TAR humana, lo que permite una simulación completa d...

Discusión

Este estudio integró técnicas de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) y transferencia de embriones (ET) para recapitular de manera integral la tecnología de reproducción asistida humana (ART) y examinar el impacto de la ICSI junto con la ET en el desarrollo de la descendencia. La aplicación de la técnica ICSI con esperma normal de ratón produjo altas tasas de fecundación (86,76%) y 2 células (88,48%). Después de ET, la tasa de natalidad de ratones descendie...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.25% avertin (2,2,2-tribromoethanol)	Nanjing Aibei	M2960	for anesthetization
Bacteriological Petri Dishes 35 x 10 mm style w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile	BD	353001
Bacteriological Petri Dishes 50 x 9 mm style w/tight lid, crystal-grade virgin polystyrene, sterile	BD	351006
Biosafety Cabinet	ESCO	class BSC	Aseptic operations, making culture dishes, aliquoting reagents, etc.
CO2 Incubator	Thermo	8000DH	Embryo culture
Dissection Microscope	Olympus	SZX16	Use in mouse embryo transfer
Fluorinert Fc-770	SIGMA	F3556	Fluorinert FC-770 is a thermally stable fully fluorinated liquid with high dielectric strength and resistivity, used as operating fluid
handheld glucometer	Roche	AccuChek performa	Blood glucose measurement
HTF	Merck	MR-070-D	The EmbryoMax Human Tubal Fluid (HTF) (1x), liquid designed for use with Mouse IVF is available in a 50 mL format and has been optimized and validated for Embryo Culture.
Hydraulic Microinjector	Eppendorf	CellTram 4r Oil, 5196000030	For sperm injection
Inverted Microscope	Nikon	TI2-U	Micromanipulation observation host
KSOM	Merck	MR-020P-D	(1x), Powder, w/o Phenol Red, 5 x 10 mL
M2	Merck	MR-015-D	EmbryoMax M2 Medium (1x), Liquid, with Phenol Red
Micromanipulator	NARISHIGE	NTX-N4	Micromanipulation arm
mineral oil	SIGMA	M8410	Mineral oil is suitable for use as a cover layer to control evaporation and cross-contamination in various molecular biology applications.
Needle Cutter	Nanjing Aibei	Sutter MF-800	Use for fabricating micromanipulation needles
Needle Puller	Nanjing Aibei	Sutter model p-100	Use for making micromanipulation needles
Piezo Drill Trip Mouce ICSI	Eppendorf	5195000.087	Application of ICSI injection needle.
Piezoelectric Micromanipulator (Membrane Breaker)	Eppendorf	Eppendorf PiezoXpert	Use of micro-pulses to break the zona pellucida and oolemma of the oocyte
Pneumatic Microinjector	Eppendorf	CellTram 4r Air, 5196000013	For fixing the oocyte
Ready-to-use Human Chorionic Gonadotropin (Hcg)	Nanjing Aibei	M2520	Sterilization reagent, intraperitoneal injection. 50 IU/mL
Ready-to-use Pregnant Mare's Serum Gonadotropin (PMSG)	Nanjing Aibei	M2620	Sterilization reagent, intraperitoneal injection. 50 IU/mL
Stereomicroscope	Olympus	SZX7	Oocyte retrieval and observation of embryo development