Obtención de imágenes in vivo de esferoides hepáticos injertados en la cámara anterior del ojo de ratón

Resumen

Aquí, describimos una plataforma que permite la obtención de imágenes in vivo no invasivas de esferoides hepáticos injertados en la cámara anterior del ojo del ratón. El flujo de trabajo abarca desde la generación de esferoides a partir de células hepáticas primarias hasta el trasplante en el ojo del ratón y la obtención de imágenes in vivo a resolución celular mediante microscopía confocal.

Resumen

Los estudios biomédicos del hígado en mamíferos se ven obstaculizados por la falta de métodos para la obtención de imágenes longitudinales no invasivas in vivo a resolución celular. Hasta ahora, la imagen óptica del hígado in situ es posible mediante imágenes intravitales, que ofrecen imágenes de alta resolución a nivel celular pero que no se pueden realizar varias veces y, por lo tanto, longitudinalmente en el mismo animal. Los métodos de imagen no invasivos, como la bioluminiscencia, permiten sesiones repetidas de imagen en el mismo animal, pero no logran la resolución celular. Para abordar esta brecha metodológica, hemos desarrollado una plataforma para la obtención de imágenes in vivo no invasivas de esferoides hepáticos injertados en la cámara anterior del ojo del ratón. En el flujo de trabajo descrito en este estudio, los esferoides primarios del hígado de ratón se generan in vitro y se trasplantan a la cámara anterior del ojo de los ratones receptores, donde se injertan en el iris. La córnea actúa como una ventana natural del cuerpo a través de la cual podemos obtener imágenes de los esferoides injertados mediante microscopía confocal convencional. Los esferoides sobreviven durante meses en el ojo, durante los cuales las células pueden ser estudiadas en contextos de salud y enfermedad, así como ser monitoreadas en respuesta a diferentes estímulos a través de repetidas sesiones de imagen utilizando sondas fluorescentes adecuadas. En este protocolo, proporcionamos un desglose de los pasos necesarios para implementar este sistema de imágenes y explicamos cómo aprovechar mejor su potencial.

Introducción

El seguimiento de la función hepática en mamíferos durante la salud y la enfermedad está limitado por la falta de técnicas de imagen in vivo no invasivas y de alta resolución. La visualización de este órgano se ve obstaculizada por su ubicación inaccesible, y para reconstruir los procesos celulares, los estudios in vivo se basan en el sacrificio de animales en diferentes puntos de tiempo. Para eludir esta limitación de la obtención de imágenes, gran parte del trabajo se basa en modelos in vitro , en los que se visualizan y estudian microtejidos similares al hígado en un entorno controlado.

En los últimos años, el desarrollo de sistemas de cultivo tridimensionales, como los esferoides hepáticos, ha ayudado y avanzado en la investigación hepática. Los esferoides hepáticos son agregados multicelulares que imitan hasta cierto punto el microambiente y las complejas interacciones célula-célula del tejido hepático¹ y ofrecen claras ventajas sobre los cultivos monocapa tradicionales ^2,3. Los esferoides hepáticos también se utilizan como modelos para diferentes enfermedades hepáticas ^4,5,6 y han sido fundamentales para comprender los mecanismos de la enfermedad. Sin embargo, las principales limitaciones de los modelos hepáticos in vitro actuales son la falta de un entorno fisiológico in vivo y el limitado tiempo de utilización en cultivo (alrededor de 20 días)³. Los esferoides hepáticos han sido previamente trasplantados a diferentes sitios in vivo, como debajo de la cápsula renal⁷ o intraperitonealmente⁸, que no son accesibles para la obtención de imágenes ópticas. La imagen hepática intravital es una técnica de última generación que ofrece imágenes en tiempo real con resolución celular. En la actualidad, esta imagen hepática in situ solo es posible en el órgano exteriorizado, que es altamente invasivo y, a menudo, terminal⁹. Aunque la colocación de una ventana abdominal permitiría repetir las sesiones de imagen hepática, implica una cirugía compleja y cuidados posteriores.

Para realizar el monitoreo longitudinal a resolución celular, exploramos el trasplante de esferoides hepáticos a la cámara anterior del ojo (ECA) de ratones, donde el tejido similar al hígado se injerta en un entorno fisiológico, conectado a los estímulos corporales y accesible para imágenes ópticas. La córnea es un tejido transparente y actúa como una ventana a través de la cual los microtejidos injertados en el iris pueden ser visualizados de forma no invasiva y longitudinal por microscopía confocal. Aquí, presentamos un flujo de trabajo de esta plataforma recientemente desarrollada para la obtención de imágenes in vivo de esferoides hepáticos¹⁰. Este protocolo es una guía paso a paso para su implementación, dividida en (1) la extracción de células hepáticas primarias de ratón y la formación in vitro de esferoides hepáticos, (2) el trasplante de esferoides hepáticos en el ECA de ratones receptores, y (3) la imagen in vivo de esferoides hepáticos injertados en ratones anestesiados. Además, mostraremos algunas de las posibilidades y aplicaciones de esta plataforma de imagen.

Protocolo

Todos los procedimientos realizados en animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentos Animales del Instituto Karolinska.

1. Extracción de células hepáticas primarias de ratón y generación de esferoides hepáticos in vitro

1. Preparación
   1. Para la canulación, la resección hepática y el aislamiento de células hepáticas primarias, prepare los siguientes materiales estériles o de un solo uso, además de las pipetas serológicas y los tubos de centrífuga (figura 1A): bomba peristáltica, centrífuga de cubo oscilante, almohadilla absorbente, estera de disección, dos pinzas de punta curva, tijeras quirúrgicas, una aguja de mariposa de 27 G, un filtro de células de 70 μm, un elevador de células, una placa de Petri de 100 mm, cámara de recuento de células y microplacas de 96 pocillos con fondo en forma de U.
   2. Prepare las soluciones utilizadas en la perfusión hepática, el aislamiento de las células hepáticas primarias y la generación de esferoides hepáticos como se enumeran en la Tabla 1.
      NOTA: El tampón de digestión y la solución de gradiente deben prepararse frescos.
   3. Configure el sistema de perfusión que consiste en una bomba peristáltica, que conduce las soluciones desde el baño de agua a 42 °C hasta el hígado (Figura 1A). La temperatura más alta del baño de agua asegura que los tampones lleguen al hígado a la temperatura óptima de 37 °C. Personalícelo en función de la longitud del tubo y la temperatura ambiente (RT).
   4. Para la canulación, coloque una aguja de mariposa de 27 G en el extremo del tubo. Mantenga los medios de recubrimiento utilizados en los pasos finales de aislamiento a 4 °C.
2. Procedimiento
   1. Precalentar las siguientes soluciones en el baño de agua a 42 °C en tubos de centrífuga de 50 mL: 40 mL de PBS, 20 mL de tampón de perfusión y 12 mL de tampón de digestión.
   2. Para limpiar y calentar los tubos de la bomba, haga circular aproximadamente 20 ml del PBS precalentado.
   3. Cambie el tubo al tampón de perfusión, cebe el tubo y la aguja de mariposa y ajuste el caudal a 4 mL/min. Asegúrese de que no haya burbujas en el tubo durante los cambios de búfer en todo el protocolo.
   4. Aplicar la eutanasia al ratón por dislocación cervical y usar agujas para fijar las extremidades a la tabla de disección.
   5. Humedecer el pelaje del abdomen con etanol al 70% y diseccionarlo para acceder a los órganos digestivos.
   6. Mueva los intestinos hacia la derecha para exponer la vena porta y la vena cava inferior (Figura 1B).
   7. Cánula de la vena cava aproximadamente a la mitad de su longitud con la aguja en posición horizontal, asegúrese de que esté estable y ponga en marcha la bomba.
   8. Cuando el hígado comience a inflarse, o aparezcan puntos blancos en los lóbulos más cercanos, corte la vena porta para permitir que la sangre y el tampón de perfusión drenen.
   9. El hígado debe comenzar a blanquearse inmediatamente. Fomente el aclarado con pinzas curvas para sujetar la vena porta a intervalos de 5 s.
   10. Repita el paso 1.2.9 hasta que el hígado esté amarillo y limpio de sangre (aprox. 15-20 ml de tampón de perfusión).
   11. Detenga la bomba peristáltica para cambiar el tubo al tampón de digestión y vuelva a encender la bomba. Cuando el tampón de digestión llegue al hígado, reduzca el caudal a 2,5 mL/min.
       NOTA: El rojo de fenol en el tampón de digestión permite discriminar su llegada al hígado y permite el ajuste de los parámetros de la bomba durante el tratamiento.
   12. Para favorecer que el tampón llegue a todos los lóbulos hepáticos y garantizar una digestión adecuada, repita el paso 1.2.9 varias veces.
   13. Detenga el flujo de la bomba peristáltica cuando el tampón de digestión se haya agotado o el hígado parezca suficientemente digerido.
       NOTA: El grado de digestión se puede controlar visualmente pellizcando suavemente los lóbulos del hígado con pinzas y comprobando si aparecen pequeñas marcas en el tejido. El hígado también se volverá endeble.
   14. Para extraer el hígado, se cortaron los ligamentos hepáticos y las conexiones dentro de la cavidad abdominal, con el objetivo de eliminarlo por completo, y se colocó en la placa de Petri que contenía 10 mL de medio de recubrimiento en frío (Tabla 1).
   15. Después de extraer la vesícula biliar, haga pequeños pellizcos en los lóbulos con pinzas, desgarrando ligeramente la cápsula hepática. Al agitar el hígado en el plato, observe las células que se vierten en el medio.
   16. Sosteniendo el hígado firmemente con fórceps, arrastre suavemente el elevador de células a lo largo de los lóbulos para liberar las células.
       NOTA: La digestión interlobulillar correcta conducirá a la suspensión celular en el medio, no a fragmentos de tejido.
   17. Con una pipeta serológica, recoja la suspensión celular de la placa de Petri y filtre a través del filtro celular de 70 μm colocado en un tubo de centrífuga de 50 mL. Utilice medios de recubrimiento nuevos para lavar el plato de células hepáticas digeridas y transferirlas al filtro.
   18. Centrifugar a 50 x g durante 5 min a 4 °C para peletizar las células.
   19. Retire el sobrenadante, dejando aproximadamente 1 mL para cubrir el pellet de la celda, agite el tubo para resuspender las células y luego agregue gradualmente 10 mL de medio de recubrimiento en frío.
   20. Agregue los 10 ml de solución de gradiente a la suspensión celular e invierta suavemente el tubo 10 veces.
   21. Centrifugar a 200 x g durante 10 min a 4 °C.
   22. El gránulo contiene células hepáticas viables enriquecidas para hepatocitos, mientras que el sobrenadante contiene células muertas y desechos. Deseche el sobrenadante con una pipeta serológica, dejando aproximadamente 1 mL, y vuelva a suspender el pellet mediante un suave remolino.
   23. Añadir 20 mL de medio de recubrimiento en frío a la suspensión celular y centrifugar a 50 x g durante 5 min a 4 °C para lavar la solución de gradiente.
   24. Retire el sobrenadante, dejando aproximadamente 1 mL por encima del pellet, y vuelva a suspender las células en 20 mL de medio de recubrimiento en frío.
       NOTA: Aquí, el pellet de celda se puede compactar, por lo que, si es necesario, use una pipeta serológica de 10 mL para disociar suavemente las células.
   25. Determine manualmente el número de células y la viabilidad utilizando una cámara de recuento de células y Trypan Blue.
       NOTA: Las células de los hepatocitos se precipitarán rápidamente en el tubo; Para volver a suspenderlos, invierta suavemente el tubo unas cuantas veces.
   26. Siembre las células hepáticas en 200 μL/pocillo de medio de siembra a 1200 células/pocillo en placas de adherencia ultrabaja de 96 pocillos.
       NOTA: El volumen óptimo de medio por pocillo es de 200 μL; sin embargo, es posible sembrar células en 100 μL/pocillo.
   27. Gire las placas a 200 x g durante 3 minutos para recoger las células en el centro de los pocillos.
   28. Incubar (37 °C, 5% CO₂) las células y dejarlas formar esferoides durante 5 días (Figura 1C) de forma natural.
   29. El día 5, retire con cuidado la mitad del medio en el pocillo y reemplácelo con un medio de mantenimiento sin suero (Tabla 1). Repita este paso cada 48 h hasta el día 10, cuando los esferoides hepáticos estén listos para ser trasplantados.
       NOTA: La formación de una estructura similar a una cápsula en esferoides hepáticos cultivados muestra una buena agregación y viabilidad.

2. Trasplante de esferoides hepáticos a la cámara anterior del ojo (ECA)

1. Preparación
   1. Para el trasplante de esferoides hepáticos en la ECA, asegúrese de disponer de los siguientes recursos (Figura 2A): microscopio estereoscópico, unidad de anestesia con isoflurano, cámara de inducción, isoflurano, almohadilla térmica, placa base metálica hecha a medida, soporte para la cabeza del ratón y máscara antigás, pinzas fijadas a la junta universal sólida, jeringa de émbolo roscado Hamilton de 500 μL, silicona, polietileno y tubo de bomba, cánula de vidrio romo hecha a medida o catéter de 24 G, etanol 70%, solución salina estéril, agujas estériles de 23 G, ungüento oftálmico (parafina líquida y vaselina en proporción 1:1), jeringa desechable de 1 mL y plato de suspensión celular de 35 mm.
   2. Limpie la jeringa, el tubo y la cánula Hamilton pasando etanol al 70% y solución salina.
   3. Llene la jeringa, el tubo y la cánula de vidrio Hamilton con solución salina y fije la jeringa Hamilton al banco en posición horizontal con cinta adhesiva (Figura 2A).
   4. Utilice una cánula de vidrio romo hecha a medida.
      1. Alargue un capilar de vidrio de borosilicato con un extractor de micropipetas de doble etapa hasta un diámetro interior de >300 μm para permitir la aspiración de los esferoides.
      2. Biselar y desafilar la punta con un biselador de microelectrodos y exponer la punta de la cánula a una llama durante unos segundos para suavizar los bordes.
         NOTA: La biseladora de microelectrodos consta de una piedra de lija giratoria que se opera manualmente; por lo tanto, la configuración específica no es aplicable.
   5. Alternativamente, construya una cánula utilizando la porción de plástico de un catéter de 24 G (Figura 2B).
   6. Prepare la unidad de isoflurano de anestesia y caliente la almohadilla térmica a 37 °C.
   7. Cubra las puntas de las pinzas unidas a la junta universal sólida con un trozo de tubo de polietileno para formar un bucle, que ayuda a estabilizar el ojo.
   8. Transfiera los esferoides hepáticos de la placa de 96 pocillos a una placa de suspensión celular de 35 mm con medios de mantenimiento utilizando una pipeta y una punta de 200 μL.
2. Procedimiento
   1. Anestesiar al ratón en la cámara de inducción con una dosis de isoflurano al 2,5% y 280 mL/min de aire.
   2. Cuando el ratón esté inconsciente, baje la anestesia al 1,8% de isoflurano y 280 mL/min de aire, conecte el tubo de anestesia al soporte de la cabeza y transfiera rápidamente al animal a la almohadilla térmica, colocando la nariz dentro del soporte de la cabeza.
   3. Inmovilice la cabeza con los tornillos, saque suavemente el ojo de la cavidad y asegúrelo con las pinzas y coloque una gota de solución salina en ambos ojos para evitar que se seque.
   4. Bajo el estereoscopio, utilice la jeringa Hamilton para aspirar y recoger los esferoides hepáticos en la punta de la cánula y déjelos reposar horizontalmente sobre una superficie limpia.
      NOTA: Los medios de aspiración junto con los esferoides hepáticos ayudan a evitar que se adhieran a las paredes de la cánula.
   5. Perfore cuidadosamente la córnea con una aguja de 23 g y seque el humor acuoso que se filtra con un pañuelo de papel. Si es necesario, para ensanchar la incisión, deslice con cuidado la aguja hacia los lados para cortar la córnea.
      NOTA: Se utiliza una aguja estéril de un solo uso para realizar la punción corneal, por lo que la córnea no se desinfecta antes de la incisión.
   6. Agregue gotas de solución salina al ojo para evitar que se seque.
   7. Tome la cánula que contiene los esferoides hepáticos y sujétela verticalmente para permitir que los esferoides graviten hacia la punta de la cánula.
   8. Inserte suavemente la cánula en el orificio y, con el bisel dirigido hacia la pupila, utilice la jeringa Hamilton para expulsar lentamente los esferoides hepáticos en la ECA (Figura 2C).
      NOTA: Antes de retirar la cánula, se recomienda esperar unos segundos para que las presiones del líquido dentro y fuera del ojo se reajusten y eviten que los esferoides se escapen fuera del ojo.
   9. Desde el exterior de la córnea, coloque los esferoides hepáticos alrededor de la pupila y lejos de la incisión pinchando suavemente la córnea con la punta de la cánula (Figura 2C).
   10. Espere ~ 5-10 minutos para que los esferoides hepáticos se asienten en el iris antes de soltar el ojo de las pinzas.
   11. Aplique un ungüento oftálmico de vaselina en el ojo operado, que ayuda a lubricar y sanar la córnea.
   12. Si lo desea, proceda a operar el segundo ojo siguiendo el mismo método.
   13. Antes de despertar al ratón, administrar un analgésico para evitar molestias postoperatorias, por ejemplo, 0,1 mg/kg de buprenorfina en solución salina estéril, administrada por vía subcutánea.
       NOTA: Solo se administró una dosis de analgésicos a los ratones, ya que se recuperaron rápidamente de este pequeño procedimiento y no mostraron ningún signo de dolor o comportamiento alterado. Dado que este procedimiento es muy rápido (dura menos de 10 minutos) y causa solo molestias menores, los ratones no requieren cuidados postoperatorios, aparte de la analgesia postoperatoria administrada antes de despertar al animal.

3. Imagen in vivo de esferoides hepáticos injertados en la ECA

1. Preparación
   1. Preparar los siguientes materiales e instrumentos para la obtención de imágenes in vivo no invasivas de esferoides hepáticos injertados en ECA (Figura 3A): microscopio confocal vertical, objetivo de inmersión en agua a larga distancia de trabajo, unidad de anestesia con isoflurano, cámara de inducción, isoflurano, almohadilla térmica, placa base de metal hecha a medida, soporte para la cabeza del ratón y máscara antigás, pinzas unidas a la junta universal sólida, gel lagrimal artificial, ungüento para los ojos (parafina líquida y vaselina en proporción 1:1).
   2. Los materiales opcionales incluyen sondas fluorescentes inyectables, jeringas desechables y agujas de 27 G para inyección intravenosa en la cola.
2. Procedimiento
   1. Anestesiar al ratón en la cámara de inducción con una dosis de isoflurano al 2,5% y 280 mL/min de aire.
   2. Cuando el ratón esté inconsciente, baje la anestesia al 1,8% de isoflurano y 280 mL/min de aire, conecte el tubo de anestesia al soporte de la cabeza y transfiera rápidamente al animal a la almohadilla térmica, colocando la nariz dentro del soporte de la cabeza.
   3. Inmovilice la cabeza en el soporte de la cabeza utilizando los tornillos.
   4. Coloque una gota de gel lagrimal artificial en ambos ojos para evitar que se sequen.
   5. En este punto, inyecte sondas fluorescentes por vía intravenosa a través de la vena de cola e imagen inmediatamente después.
   6. Inclina la cabeza, saca suavemente el ojo de la órbita y asegúralo con pinzas y colócalo en su posición debajo del objetivo.
   7. Aplique una cantidad generosa de gel lagrimal artificial para llenar el espacio entre la córnea y el objetivo y concéntrese en los esferoides hepáticos a través del ocular.
      NOTA: Si es posible, retire el ocular de uno de los oculares para obtener una visión no ampliada y localizar más fácilmente los esferoides en el iris.
   8. Para obtener imágenes de alta resolución a pesar de los movimientos respiratorios del animal, utilice objetivos de 25x y los siguientes ajustes de imagen: formato de 512 x 512 píxeles, velocidad de escaneo de 600 Hz y un grosor de pila Z de 3 μm. Consulte la configuración detallada de imágenes en la Tabla 2.
      NOTA: A lo largo de las imágenes, la concentración de anestesia se ajusta de 1,6 a 2,2 mL/h de isoflurano para lograr un ritmo respiratorio poco profundo y controlado y, por lo tanto, minimizar el movimiento del animal.
   9. Al final de la sesión de imagen, trate los ojos de la imagen con ungüento oftálmico de vaselina antes de retirar el isoflurano y despertar al animal.

Discusión

Este protocolo describe una nueva plataforma para la obtención de imágenes intraoculares in vivo de esferoides hepáticos injertados en la ECA. El ECA se ha utilizado previamente como sitio de trasplante de otros microtejidos derivados de órganos, como los islotes pancreáticos^11,12, debido a su microambiente de injerto único, rico en vasos, nervios y oxígeno, y al acceso a las imágenes a través de la córnea. Si bien las imágenes hepáticas intravitales permiten la visualización de células y procesos in situ, la monitorización longitudinal no es posible. Las imágenes del hígado a través de una ventana abdominal implican una cirugía compleja, y el movimiento del órgano dentro del cuerpo dificulta el seguimiento de una sola célula a lo largo del tiempo. Por lo tanto, este novedoso método de imagen permite la monitorización longitudinal no invasiva de las células hepáticas con una resolución de una sola célula.

Este protocolo se divide en tres partes. El primero es el aislamiento de los hepatocitos primarios mediante perfusión de colagenasa en dos etapas, adaptado de Charni-Natan et ^al.13, con la diferencia de que realizamos la perfusión hepática en el ratón muerto en lugar de en los animales vivos anestesiados. Esta variación trae ciertas ventajas, como menos consideraciones éticas y la evitación de residuos de anestesia en el organismo. En este trabajo, generamos esferoides hepáticos a partir de la fracción enriquecida con hepatocitos del aislamiento, pero esto no excluye el potencial de aislar otras poblaciones celulares no parenquimatosas utilizando otros protocolos especializados para hacer esferoides de cocultivo de composición diversa^14,15.

La segunda parte de este protocolo consiste en el trasplante de los esferoides hepáticos en la ECA de los ratones receptores. Se trata de una cirugía rápida (menos de 10 min) y sencilla realizada en ratones anestesiados y que no requiere ningún tratamiento postoperatorio. La punción de la córnea se autosella y se cura en 3-5 días. Ocasionalmente, durante el proceso de curación, se observan algunas novatadas alrededor de la incisión, pero esto desaparece a los pocos días. No hemos experimentado casos de sinequia anterior en los ojos de animales operados. Realizamos los procedimientos de trasplante en un laboratorio limpio pero al aire libre y sin problemas de infecciones en los ojos operados. La inoculación e injerto de esferoides en el ojo no compromete la visión ni altera el comportamiento del animal receptor. En este protocolo, utilizamos anestesia con isoflurano tanto para la cirugía de trasplante como para la obtención de imágenes in vivo , que es bien tolerada en ratones. Debido a su efecto dependiente de la dosis, se puede ajustar fácilmente a lo largo de los procedimientos y tiene la ventaja de reducir los tiempos de sueño y despertar. Sin embargo, se pueden utilizar anestésicos inyectables alternativos. Después del trasplante, generalmente dejamos pasar 1 mes para que los esferoides se injerten completamente, se vascularicen y se inerven, antes de realizar intervenciones de tratamiento e imágenes in vivo . También hemos demostrado que el trasplante y el injerto son posibles utilizando esferoides hepáticos humanos y ratones receptores inmunocomprometidos¹⁰.

La tercera parte de este método es la obtención de imágenes in vivo de los esferoides hepáticos injertados en la ECA. Este protocolo describe la configuración de imágenes in vivo, que utiliza equipos de microscopía que se encuentran comúnmente en las instalaciones de imágenes de investigación. Además, los materiales especializados, como el soporte para la cabeza del ratón y la cánula de plástico, ahora están disponibles comercialmente. Con esta configuración de imágenes, podemos capturar secciones z y obtener una reconstrucción tridimensional de la arquitectura del esferoide, dependiendo de la profundidad de penetración del láser y la detección de fluorescencia. El monitoreo de la función celular en los esferoides hepáticos injertados se basa en la visualización de proteínas fluorescentes que informan sobre los tipos de células, las funciones celulares y la dinámica. Por lo tanto, esta plataforma de imágenes se puede explotar utilizando diferentes modalidades, solas o en combinación: (1) Las sondas fluorescentes se pueden administrar por vía intravenosa, por ejemplo, anticuerpos para marcar y rastrear células, así como colorantes funcionales; (2) Los esferoides hepáticos se pueden generar a partir de células aisladas de modelos de ratón reporteros que expresan proteínas fluorescentes específicas del hígado, por ejemplo, esferoides hepáticos FUCCI que informan sobre la dinámica del ciclo celular; (3) La formación de esferoides hepáticos in vitro puede combinarse con la transfección o la transducción, para equipar a los esferoides con proteínas fluorescentes y biosensores. por ejemplo, virus adenoasociados. En nuestros entornos experimentales y mediante el uso de un solo fotón para la excitación, la profundidad de imagen que es posible alcanzar es de aproximadamente 60-100 μm. Sin embargo, esto depende de la potencia del láser y de la disponibilidad de imágenes multifotónicas, de las características de emisión de la sonda de fluorescencia y de la sensibilidad de los detectores, así como del ángulo del ojo en el que se injerta el esferoide. Después de la adquisición de imágenes, el análisis de imágenes posteriores se puede realizar utilizando programas populares como Image J e Imaris. Por ejemplo, en el caso del reportero FUCCI, las células activas del ciclo celular en verde se pueden contar y contrastar con el número total de glóbulos rojos para evaluar la actividad del ciclo celular dentro del esferoide injertado. Además, la plataforma de imágenes ACE permite aplicar sustancias en el ojo (en forma de gotas oftálmicas) o inyectarlas directamente en el ACE para tratar el injerto y controlar su reacción. Los esferoides trasplantados post-mortem pueden recuperarse fácilmente mediante microdisección manual y pueden aportar información valiosa mediante técnicas ex vivo, como tinción de inmunofluorescencia, análisis transcriptómico, etcétera10.

Esta técnica tiene ciertas limitaciones. La primera es que, según nuestra experiencia, los ratones receptores deben ser albinos, es decir, tener el iris no pigmentado. Tras el injerto, los esferoides hepáticos quedan cubiertos por una monocapa de células del iris, lo que no afecta a la viabilidad ni a la función de los esferoides, pero el pigmento de las células del iris impide la obtención de imágenes. Una segunda consideración es la estabilidad durante la obtención de imágenes intraoculares en ratones anestesiados. Durante las sesiones de imágenes in vivo , la concentración de anestesia y la respiración del animal deben ser monitoreadas de cerca para minimizar el movimiento. Sin embargo, utilizando la configuración de imagen indicada aquí, podemos lograr imágenes de alta resolución a nivel de una sola célula.

En resumen, este protocolo describe la implementación de una plataforma de imagen in vivo no invasiva de tejido similar al hígado injertado en los ojos de ratones. Utilizamos procedimientos sencillos, equipos comunes y materiales asequibles, lo que lo convierte en un enfoque asequible para muchos investigadores. Este modelo combina las ventajas de los esferoides hepáticos en 3D in vitro con el entorno in vivo y la accesibilidad óptica proporcionada por el ACE para crear una valiosa plataforma para el estudio de la fisiología y la patología hepática en investigación básica y entornos preclínicos.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
27 G butterfly needle	Venofix	4056388
AAV8-CAG-GFP	Charles River	CV17169-AV9	Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation
Absolute and 70% ethanol	N/A	N/A
Absorbent pad	Attends	203903
Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)	Jackson	#003574 and #007914	Mice obtained from in-house breeding
B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J)	Jackson	#000058	Mice obtained from in-house breeding
B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH	INFRAFRONTIER/EMMA	EM:08395	Mice obtained from in-house breeding
BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in	BD Medical	381212
Borosillicate standard glass cappilaries	World Precision Instruments	1B150-4
Cell lifter	Corning	3008
Cell strainer, 70 µm	Falcon	352350
Custom-made metal plate	Hardware store	N/A
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narshige	Model PC-100
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Electric heating pad	Hardware store	N/A
FBS	Gibco	N/A
GlutaMAX	Gibco	35050061
Green CMFDA	Abcam	ab145459	Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS
Hamilton syringe	Hamilton	81242	Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL
HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red	Gibco	14175095
HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective	Leica	N/A
HEPES	Gibco	15630080
Induction chamber 0.8 L	Univentor	8329001
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G)	Gibco	41400045
Isoflurane	Baxter	N/A
Lectin DyLight-649	Invitrogen	L32472	Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse
Liberase TM Research Grade	Sigma-Aldrich	5401127001
Microelectrode beveler	World Precision Instruments	Model BV-10
Mouse head-holder and gas mask	Narshige	Model SGM-4
Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate	Thermo Fisher	174929
Oculentum simplex	APL	N/A
PBS 10x	Gibco	14080055
PBS 1x; no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644
Peristaltic pump	Ismatec	Model ISM795
PharMed BPT Pump Tubing	VWR	VERN070540-07	Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm
pHrodo Red-LDL	Invitrogen	L34356	Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse
Portex Fine Bore Polyethylene Tubing	Smiths Medical	800/100/140	Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm
Silicone dissection mat	Hardware store	N/A
Sodium chloride 0.9%	Braun	N/A
Solid Universal Joint	Narshige	Model UST-2
Stereomicroscope	Leica	Model M80
Suspension culture dish 35 mm	Sarstedt	833900500
Temgesic	Indivor	N/A	Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse
Translucent Silicone Tubing	VWR	228-1450	Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
Univentor 400 Anesthesia unit	Univentor	8323001
Upright laser scanning confocal microscope	Leica	Model TCS SP5 II
Viscotears	Novartis	N/A
William's E Medium; no glutamine, phenol red	Gibco	22551089