Establecimiento de un modelo experimental de endometrioma en ratones para estudiar su infertilidad relacionada

Resumen

Este estudio presenta un nuevo modelo de ratón diseñado específicamente para simular el endometrioma, un subtipo clínicamente significativo de endometriosis. Mediante la utilización de ratones C57BL/6J, el modelo tiene como objetivo dilucidar los mecanismos fisiopatológicos que subyacen a la infertilidad relacionada con el endometrioma, ofreciendo una herramienta refinada para cerrar la brecha de conocimiento actual en medicina reproductiva.

Resumen

El endometrioma (OMA), un subtipo de endometriosis caracterizada por la formación de quistes endometriósicos en los ovarios, afecta al 17-44% de las personas diagnosticadas con endometriosis. Las mujeres con OMA a menudo experimentan una fertilidad comprometida, sin embargo, los mecanismos exactos que subyacen a la infertilidad asociada a la OMA siguen sin estar claros. En particular, los modelos animales existentes simulan la endometriosis peritoneal superficial (SUP) y la endometriosis infiltrante profunda (DIE), lo que deja un vacío notable en la investigación centrada en la OMA. En respuesta a la falta de conocimiento, este artículo presenta un modelo de ratón pionero que simula OMA y proporciona una descripción completa de las técnicas y procedimientos empleados en el modelo. Con una alta tasa de éxito del 83% y una especificidad de la lesión ovárica, este modelo es muy prometedor para avanzar en nuestra comprensión de la OMA, particularmente en el contexto de la infertilidad. Ofrece una plataforma valiosa para llevar a cabo investigaciones específicas sobre los desafíos de fertilidad asociados a la OMA, lo que podría allanar el camino para mejorar las estrategias diagnósticas y terapéuticas en el campo de la medicina reproductiva.

Introducción

El endometrioma (OMA) es el subtipo de endometriosis más predominante, observado en aproximadamente el 17-44% de las personas diagnosticadas de endometriosis ^1,2. Se caracteriza por la formación de quistes endometriósicos dentro de los ovarios. Estos quistes, denominados coloquialmente "quistes de chocolate", derivan su nombre de su distintiva consistencia marrón parecida al alquitrán³. Además de la OMA, la endometriosis también puede presentarse como endometriosis peritoneal superficial (SUP) y endometriosis infiltrante profunda (DIE). La SUP se refiere a las lesiones en el revestimiento peritoneal, mientras que la DIE se refiere a las lesiones que penetran más de 5 mm por debajo de la superficie peritoneal⁴. La heterogeneidad en la localización, apariencia y profundidad de la lesión entre estos subtipos de endometriosis da lugar a diversos síntomas clínicos y a una gravedad variable de la enfermedad ^5,6. La OMA se asocia particularmente con etapas más graves de endometriosis y se ha implicado en infertilidad, adherencias pélvicas y un mayor riesgo de cáncer de ovario 1,7,8,9.

La asociación de la endometriosis, especialmente la OMA, con la infertilidad es un problema clínico de gran preocupación. La endometriosis está presente en el 25-50% de las mujeres infértiles, y el 30-50% de las mujeres diagnosticadas con endometriosis experimentan infertilidad 10,11,12,13,14. Si bien los mecanismos exactos de infertilidad asociados a OMA siguen siendo difíciles de alcanzar, se han planteado algunas hipótesis. Uno sugiere que la endometriosis conduce a un estado inflamatorio crónico, que puede alterar la función ovárica normal y perjudicar la calidad de los ovocitos^15,16. Otro propone una sobrecarga anormal de hierro en el líquido folicular ovárico, que se cree que está asociada con el trastorno de la maduración de los ovocitos¹⁴. Otros estudios abordan las alteraciones en la regulación hormonal¹⁷, la calidad de los ovocitos¹⁸ y el desarrollo embrionario¹⁹.

Históricamente, los modelos de roedores han desempeñado un papel crucial en la profundización de nuestra comprensión de la endometriosis, particularmente en el estudio de su patología, su impacto en la fertilidad y los mecanismos del dolor 20,21,22,23. Los roedores, particularmente ratas y ratones, han sido ampliamente utilizados como modelos animales para explorar las relaciones de causa y efecto, los mecanismos subyacentes, las posibles técnicas de diagnóstico y las intervenciones terapéuticas para esta enfermedad 22,24,25,26. Es importante reconocer que todos los modelos animales tienen sus usos y limitaciones específicas. La elección de un modelo en particular depende del resultado o aspecto específico que se esté midiendo o estudiando²⁷. Por ejemplo, un modelo de rata demostró que el estrés podría exacerbar las manifestaciones de la endometriosis e influir en los parámetros inflamatorios, proporcionando información sobre los posibles desencadenantes de la enfermedad²⁸.

En el contexto de la investigación sobre la endometriosis, se emplean varios modelos de roedores. Un enfoque comúnmente utilizado es el modelo homólogo, que implica el trasplante de tejido uterino de roedores a la cavidad peritoneal o a los vasos mesentéricos de la misma especie²⁹. Este modelo ofrece ventajas en términos de inmunocompetencia e idoneidad para estudios a largo plazo³⁰. Sin embargo, surgen limitaciones debido a la disparidad parcial entre el tejido uterino ectópico de ratón implantado y las características de las lesiones endometriósicas humanas³¹. Otro enfoque es el modelo heterólogo, en el que se implanta una biopsia endometrial humana en un ratón inmunosuprimido³². Este modelo permite el uso del endometrio ectópico humano como tejido donante para el desarrollo de la lesión, proporcionando validez constructiva³². Sin embargo, se basa en ratones inmunodeprimidos como receptores, lo que dificulta una evaluación exhaustiva de las respuestas inmunitarias implicadas en la etiología del trastorno³³. Sin embargo, es importante reconocer que los modelos existentes se centran principalmente en reflejar la condición generalizada SUP, capturando inadecuadamente las características únicas de OMA y DIE³⁴. En la actualidad, existe una escasez de modelos específicos disponibles para el estudio de la DIE, existiendo solo unos pocos modelos, incluido un modelo reciente de roedores desarrollado por Yan et ^al.35. Esta escasez subraya la necesidad de seguir investigando y desarrollando modelos que capturen con precisión las características específicas de la DIE. Además, nuestra comprensión de la OMA, especialmente su asociación matizada con la fertilidad, también sigue siendo limitada^26,36.

Abordando los desafíos existentes, este artículo presenta un nuevo modelo experimental de ratón homólogo diseñado para simular específicamente OMA. Su objetivo es proporcionar información única sobre los mecanismos patológicos que subyacen a la infertilidad relacionada con la OMA, cerrando así la brecha de conocimiento en esta área crucial de la medicina reproductiva. En resumen, se utilizaron ratones C57BL/6J por sus rasgos reproductivos similares a los humanos. Después de la sincronización del ciclo estral, los tejidos uterinos de los ratones donantes se picaron y se trasplantaron a la bolsa ovárica de los ratones receptores en una proporción de 1:2. Después de un intervalo de 4 semanas, se realizaron exámenes morfológicos e histológicos de las lesiones ováricas para validar la presencia de OMA y evaluar cualquier atresia folicular asociada. Con una tasa de éxito del 83%, este modelo ofrece a los investigadores una plataforma confiable para los estudios de OMA, enfatizando el desarrollo de lesiones específicamente en los ovarios para investigaciones enfocadas.

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Protocolo

Todos los procedimientos experimentales realizados en este estudio fueron aprobados y regulados bajo el protocolo número 21-203-MIS_[C] por el Comité de Ética de la Universidad China de Hong Kong.

1. Aclimatación y selección de animales

1. Preparación de ratones
   1. Obtenga 18 ratones C57BL/6J (hembras primíparas, de 8-9 semanas de edad: 6 donantes, 12 receptores) de un proveedor de confianza. Verifica los certificados de salud.
   2. Mantener a todos los ratones en un entorno de alojamiento controlado: 22-24 °C, niveles de humedad entre el 40% y el 60%, y con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h. Use aire filtrado por HEPA, si está disponible.
   3. Permitir 72 horas de aclimatación para los ratones con acceso continuo a comida y agua, minimizando la interacción humana para reducir el estrés.
2. Sincronización del ciclo estral
   1. Recoja la ropa de cama que contenga feromonas masculinas; Introdúcelo en jaulas de hembras durante 48 h.
3. Citología vaginal
   1. Realice la citología vaginal a la mañana siguiente.
      NOTA: Es necesario realizar una frotis a una hora constante del día, generalmente a las 9:00 a.m.
      1. Prepare hisopos de algodón de doble cabeza, PBS esterilizado en autoclave, una placa de Petri de 35 mm y portaobjetos de vidrio con anticipación. Dispensar 10 mL de PBS en una placa de Petri. Sumerge un extremo del hisopo de algodón en el PBS para permitir que absorba el líquido.
      2. Saca suavemente un ratón de su jaula y colócalo en la tapa de una jaula vacía.
      3. Agarre la cola con el pulgar y el índice de una mano, y con la otra mano tome el hisopo de algodón humedecido e insértelo delicadamente en la vagina del ratón. Inserte con cuidado la punta del bastoncillo a una profundidad de aproximadamente 1,0 cm en la vagina del ratón. Gire el hisopo suavemente, manteniendo un ángulo de aproximadamente 45° con respecto al eje largo del cuerpo del animal.
         NOTA: Rotar el hisopo lentamente durante la inserción puede facilitar un procedimiento más suave y minimizar la posible estimulación del cuello uterino.
      4. Extraiga suavemente las células de la luz y las paredes vaginales girando continuamente el hisopo y, a continuación, retire el hisopo con cuidado.
         NOTA: Durante este proceso, asegúrese de que el hisopo se gire continuamente y tenga cuidado de no entrar en contacto con los pelos circundantes. Después, retire con cuidado el hisopo para evitar cualquier posible contaminación.
      5. Transfiera las células recolectadas haciendo rodar suavemente la punta del hisopo sobre un portaobjetos de vidrio limpio y preetiquetado.
         NOTA: La varilla de hisopo debe desecharse después de transferir las células a los portaobjetos, y se debe usar uno nuevo para cada animal.
      6. Inspeccione los portaobjetos bajo un microscopio para detectar células epiteliales córneas. Busque la presencia uniforme de células epiteliales córneas en la citología vaginal, que es indicativa de la etapa de celo. Capturar fotografías y registrar las observaciones.
         NOTA: Con la experiencia adecuada, no es necesario tintar los frotis vaginales. Sin embargo, si un experimentador no puede "leer" los frotis sin que se manchen, entonces es necesario.

2. Establecimiento del modelo de endometrioma

NOTA: Solo seleccione ratones en la etapa de celo como ratones donantes y receptores en el establecimiento modelo. Al realizar experimentos con un ratón, asegúrese de que esté fuera de la vista de los demás y de que no se vuelva a introducir en compañía de otros animales hasta que se recupere por completo. El diagrama de generación del modelo se puede encontrar en la Figura 1.

1. Preparación de tejidos del donante
   1. Sedar a los ratones donantes con una combinación de ketamina (75 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg). Eutanasia de los ratones donantes mediante translocación cervical bajo anestesia.
   2. Desinfectar la zona abdominal con un hisopo de etanol al 70%.
   3. Use tijeras quirúrgicas estériles para crear una incisión (1 cm) a lo largo de la línea media del peritoneo para exponer la capa muscular. Elige otro par de tijeras quirúrgicas para cortar la capa muscular y revelar la cavidad pélvica.
   4. Cierre las puntas de las pinzas y levante suavemente los intestinos con la parte central roma.
   5. Localiza el útero y los tejidos ováricos. Realice una disección estéril de todo el cuerno uterino, incluidos ambos cuernos uterinos, asegurándose de que el tamaño aproximado de la pieza que se extrae sea de ~ 1,5 cm de longitud. Coloque los tejidos extirpados en una placa de Petri que contenga PBS y elimine el exceso de tejido graso.
   6. Diseccionar minuciosamente los tejidos en trozos de 1 mm³ con un bisturí esterilizado. Mantenga los pañuelos húmedos agregando periódicamente PBS.
2. Procedimiento de trasplante
   1. Anestesiar a los ratones receptores con una mezcla de ketamina (75 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg).
   2. Aplique ungüento oftálmico para prevenir la sequedad ocular durante la cirugía. Coloque los ratones en posición supina sobre una tabla quirúrgica estéril.
   3. Determine el sitio quirúrgico manipulando suavemente las patas traseras del ratón, con una prominencia ósea palpable debajo de la piel. Este punto de prominencia, claramente visible a través de la piel, sirve como un marcador anatómico fiable para los ovarios del ratón receptor durante el procedimiento quirúrgico.
   4. Afeita el sitio quirúrgico, asegurándote de que el 150% del área que lo rodea esté libre de pelo. Luego, desinfecte la piel con rondas alternas de betadine y alcohol al 70% al menos 3 veces. Use un paño quirúrgico estéril para evitar el contacto entre los tejidos, los instrumentos estériles y las suturas con cualquier resto de piel. Finalmente, cree una incisión lateral precisa (3-5 mm) en el sitio quirúrgico predeterminado.
   5. Estabilice el ovario con pinzas de mano no dominantes. Inyectar suavemente 100 μL de PBS en la bolsa ovárica, observando la ligera separación.
   6. Haz una pequeña hendidura en la bursa. Trasplante de los fragmentos de tejido uterino (1 mm³) con micropinzas.
      NOTA: Evite rellenar en exceso para evitar la presión sobre los tejidos circundantes.
   7. En el caso de la cirugía simulada, repita todos los pasos excepto el paso 2.2.6.
3. Cuidados postoperatorios
   1. Sutura las capas musculares con suturas reabsorbibles (es decir, 5-0 vicryl) y la piel con suturas no absorbibles (es decir, 5-0 nylon).
   2. Coloque un ratón sobre una almohadilla térmica ajustada a 37 °C hasta que vuelva la plena conciencia. Controle la respiración y espere a que las extremidades se pongan rosadas.
   3. Administrar buprenorfina (0,1 mg/kg, por vía subcutánea) para el dolor cada 12 h durante 48 h. Verifique si hay signos de dolor, infección o angustia cada 8 horas durante las primeras 24 horas y luego 3 veces al día durante los próximos 3 días.
      NOTA: El animal no se deja desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener el decúbito esternal.

3. Validación del modelo

1. Validación bruta
   1. Después de 4 semanas, anestesiar a los ratones receptores con una combinación de ketamina (75 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg). Luego, bajo anestesia profunda, se practica la eutanasia a los ratones mediante la translocación cervical.
   2. Realice una incisión en la línea media y exponga la cavidad abdominal para la inspección del órgano.
   3. Extraer los ovarios con lesiones visibles y tomar fotografías.
   4. Inspeccione minuciosamente si hay lesiones endometriósicas externas.
2. Validación histológica
   NOTA: Debido a la presencia de disolventes odoríferos potencialmente irritantes en los experimentos histológicos, debe realizarse en una campana extractora.
   1. Fijar los ovarios junto con las lesiones en formol tamponado neutro al 10%.
   2. Procese los tejidos siguiendo los mismos procedimientos descritos por Adeniran et ^al.37, incluyendo la asignación de tejidos, la fijación y la incrustación.
   3. Corte en serie tejidos de 4-5 μm de grosor, flote en un baño de agua a 45 °C y móntelo en portaobjetos de vidrio. Etiquete claramente los portaobjetos con el número del ratón, el lado del ovario y el número de sección. Secar toda la noche a 37 °C.
   4. Tinción de PAS-hematoxilina
      1. Desparafinación: Coloque los portaobjetos en xileno o un sustituto de xileno para eliminar la parafina.
         NOTA: Es posible que deba realizar este paso un par de veces.
      2. Rehidratación: Rehidratar gradualmente las secciones de tejido colocando los portaobjetos en una serie de concentraciones decrecientes de etanol (100%, 95%, 80%, 70%).
      3. Tratamiento con ácido peryódico: Cubra las secciones de tejido con una solución de ácido peryódico al 1% y déjelas reposar durante 5-10 minutos a temperatura ambiente.
         NOTA: Este paso oxida los grupos glicol del tejido a grupos aldehído, lo que permite la reacción con el reactivo de Schiff y la formación de una tinción rosa púrpura para indicar las estructuras ováricas.
      4. Enjuague bien los portaobjetos con agua destilada para eliminar cualquier ácido peryódico residual.
      5. Tiñe las secciones de tejido con una solución de Schiff durante 15 min.
      6. Enjuague los portaobjetos primero con agua corriente caliente del grifo para eliminar el exceso de mancha, luego con agua destilada.
      7. Contratiñir las secciones con 1 g/L de hematoxilina de Meyer durante 2-3 min.
      8. Enjuague los portaobjetos con agua corriente del grifo durante 2-3 minutos.
      9. Aplique el reactivo azulado durante 30 s.
      10. Enjuague los portaobjetos en agua destilada.
      11. Deshidratar gradualmente las secciones sumergiéndolas en concentraciones crecientes de etanol (70%, 80%, 95% y 100%).
      12. Sumerja las secciones en un agente de limpieza (por ejemplo, xileno) para hacerlas transparentes.
      13. Aplique un medio de montaje a las secciones de los portaobjetos y coloque suavemente un cubreobjetos sobre las secciones, asegurándose de que no haya burbujas de aire. Deje que las correderas se sequen al aire en la campana para facilitar la solidificación del medio de montaje.
   5. Examinar bajo un microscopio óptico. Documentar la presencia de glándulas endometriales, estroma y quistes hemorrágicos que confirmen la endometriosis en el ovario.

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Resultados

El exitoso establecimiento de OMA
De los 12 ratones sometidos al protocolo de trasplante, 10 presentaron lesiones características de OMA, tanto a nivel anatómico macroscópico como histológico, lo que se traduce en una tasa de éxito del 83%. El examen macroscópico reveló lesiones llenas de líquido adheridas a los ovarios, que recuerdan a las presentaciones clínicas de OMA (Figura 2). El escrutinio histopatológico, como se ilustra...

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Discusión

La prevalencia de la OMA en la población femenina mundial pone de relieve un problema crítico de salud³⁸. Más allá de los síntomas generales de la endometriosis, la OMA presenta desafíos adicionales para la fertilidad, incluido el dolor pélvico intenso, la posibilidad de torsión ovárica y otras implicaciones notables^39,40. Si bien la comprensión de la patogénesis y la progresión de la OMA está...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 cc syringe with 25 G needle	BD Biosciences	301320
10 mm Tissue culture dish	FALCON	353001
10% Buffered formalin	Fisher Scientific	SF100-4
10x phosphate buffered saline (PBS) buffer	Fisher Scientific	AM9625
30 G needle	BD Biosciences	305107
5-0 black braided silk non-absorbable suture	Ethicon Inc.	W500H
70% Ethanol
Adhesive microscope slides	Marienfeld	810401
Buprenorphine Injection	Med-Vet International	RXBUPRENOR5
Double-headed cotton swab	SANYO Co., LTD.	HUBY-340
Fine forceps	Fine Science Tools	11254-20
Ketamine	Alfasan International b.v	2203095-08
Microtubes	Corning	MCT-150-C
Needle holder	Excelta Corporation	2827-NH-35-SE-ND
Ophthalmic ointment	Major Pharmaceuticals	10033691
Periodic Acid Schiff (PAS) Stain Kit	Abcam	Ab150680
Powder free sterile gloves	Fisher Scientific	19020558
Processing/embedding cassettes	Fisher Scientific	15-197-700A
Size 3 scalpel	Fisher Scientific	22-079-657
Small serrated semi-curved forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5135
Small surgical scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5850
Standard light microscope			For evaluating vaginal cytology smears and histological analysis.
Steel scalpel blades #10	B.Braun	BB510
Sterile gauze	MEDICOM	HMWS 077
Sterilized pyrex glass Petri dishes	Corning	70160-101
Thermoregulated electric pad
VICRYL RAPIDE (polyglactin 910) absorbable Suture	Ethicon Inc.	W9918
Xylazine	Alfasan International b.v	2110333-10