Microscopía intravital de dos fotones de glioblastoma en un modelo murino

Resumen

Presentamos un enfoque novedoso para la microscopía de dos fotones de la administración tumoral de nanopartículas de óxido de hierro marcadas con fluorescencia al glioblastoma en un modelo de ratón.

Resumen

La administración de terapias contra el cáncer administradas por vía intravenosa a los tumores cerebrales está limitada por la barrera hematoencefálica. Un método para obtener imágenes directas de la acumulación y distribución de macromoléculas en tumores cerebrales in vivo mejoraría en gran medida nuestra capacidad para comprender y optimizar la administración de fármacos en modelos preclínicos. Este protocolo describe un método para el seguimiento in vivo en tiempo real de nanopartículas marcadas con fluorescencia administradas por vía intravenosa con microscopía intravital de dos fotones (2P-IVM) en un modelo de ratón de glioblastoma (GBM).

El protocolo contiene una descripción de varios pasos del procedimiento, que incluye la anestesia y analgesia de animales de experimentación, la creación de una ventana craneal, la implantación de células GBM, la colocación de una barra en la cabeza, la realización de estudios 2P-IVM y la atención posquirúrgica para estudios de seguimiento a largo plazo. Mostramos sesiones representativas de imágenes 2P-IVM y análisis de imágenes, examinamos las ventajas y desventajas de esta tecnología y discutimos las posibles aplicaciones.

Este método puede modificarse y adaptarse fácilmente a diferentes preguntas de investigación en el campo de las imágenes cerebrales preclínicas in vivo .

Introducción

La microscopía intravital de dos fotones (2P-IVM) es una técnica de imagen por fluorescencia que permite la visualización de tejido vivo¹.

Desarrollada por primera vez en la década de 1990, la 2P-IVM se ha utilizado para el análisis in vivo de la retina², el riñón³, el intestino delgado⁴, la cóclea⁵, el corazón⁶, la tráquea^{7 y el} cerebro en varios modelos preclínicos ^8,9. En el campo de la neurocie....

Protocolo

El procedimiento con animales descrito en este protocolo está de acuerdo con los requisitos del Panel Administrativo sobre el Cuidado de los Animales de Laboratorio (APLAC).

1. Cultivo celular

1. Preparación de la campana
   1. Lávese las manos, use guantes y una bata de laboratorio. Encienda el armario de seguridad biológica y ajuste el nivel de la hoja a una altura de apertura adecuada. Deje que la campana se purgue durante 3-5 minutos. Rocíe el área de la capucha con etanol al 70% y límpiela con papel de seda.
   2. Rocíe todos los reactivos con etanol al 70% y limpie con papel de seda. Mueva los reactivos a....

Discusión

Presentamos un método para el seguimiento in vivo de NP en tiempo real utilizando 2P-IVM a través de una ventana craneal para evaluar la administración tumoral de NP de óxido de hierro marcadas con fluorescencia. La técnica quirúrgica para este procedimiento requiere una mano firme y habilidades quirúrgicas experimentales avanzadas. Es recomendable practicar el uso de cadáveres o fantasmas antes de pasar a la experiencia con animales vivos. Como alternativa, Hoeferlin et al. implementaron un taladro rob?.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride infusion solution	Baxter Corp	533-JB1301P
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
1 mL syringes	BD	Luer-Lok syringe, REF309628
10% FBS	Thermo fisher	Cytiva SH30910.03HI
10% DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
2-photon microscope	Prairie Technologies, Bruker	Prairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%	Medline Industries, LP	MDS093810
Alcohol, spray bottle	Decon Labs Inc	Decon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foil	Reynold Brands	Reynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machine	Patterson Scientific	SAS3
Anesthesia monitoring	Kent Scientific	MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid	Invitrogen	15240-096
Betadine applicators	Professional Disposables International, Inc	S41125
Biopsy punch, 5 mm	Miltex	Size 5
Buprenorphine sustained release	Zoo Pharm	Bup SR Lab, 1.0 mg/mL	A generic drug can be used instead.
C6 rat glioma cell line	ATCC (American Tissue Culture Collection)	CCL-107
Cannulas	BD	16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
Carprofen	Pfizer	Rimadyl, 50 mg/ml	A generic drug can be used instead.
Cefazoline	Sagent Pharmaceuticals	25021-101-10, 1 g/vial	A generic drug can be used instead.
Cell strainer, 40 µm	Fisher Scientific	87711
Cotton tip applicators, 6”	Dyad Medical Sourcing, LLC	HCS1005
Dental cement	Stoelting Co	51459	Dental cement kit, clear, 2 components
Dexamethasone	Bimeda	138RX, 2 mg/mL	A generic drug can be used instead.
DietGel	ClearH2O	Recovery, 72-06-502
Drape	Cardinal Health	Bio Shield Wrap
Drill	Saeyang Microtech	Escort Pro, B08350
Drill tips	Hager & Meissinger GmbH	REF310104001001005	Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis software	National Institute of Health	https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Fisher Scientific	13-812-41
Gauze	Fisher HealthCare	Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam	Ethicon Inc.	Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator	Cellpoint Scientific	Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameter	Fisher Scientific	Menzel Cover glass
Gloves, non-sterile	Fisher Scientific	Nitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterile	Medline Industries, LP	MDS104070
Hair removal cream	Church & Dwight	Nair Hair remover lotion
Hamilton syringe	Hamilton Company Inc	Gastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, Mg	Fisher Scientific	PI88284
Head bar	Hongway	5 mm inner diameter O-rings
Heating pad	Stoelting Co.	Rodent warmer X2
Insulin syringes	Exel International Medical Products	29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticles	Covis Pharma GmbH	Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
Isoflurane	Dechra	26675-46-7
Mice	Jackson Laboratories	NSG, Strain 005557
Microscope (surgery)	Seiler Medical	Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticles	Custom		Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointment	Major pharmaceuticals	Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
Oxygen	Linde Gas & Equipment Inc.	High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cups	Georgia-Pacirif Consumer Products	Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubing	Braintree Scientific	50-195-5494
Scale	Ohaus Corp	CR2200
Scalpel	Integra Life Sciences Production Corp	Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel
Scissors	Fisher Scientific	13-804-18
Sealant	Henkel Corp	Loctite 4014
Single use lab gown	High Tech Conversions	17-444-081
Stereotactic frame	Stoelting Co.	Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems	Fisher Scientific	S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam box	N/A	N/A
Surgical gloves	Cardinal Health	19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive	3M Animal Care Prodcuts	1469SB
Tail vein cathether	Custom		Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing
TrypLE Express (1x), no phenol red	Invitrogen	12604-039
Ultraviolett torch	Spring sunshine technology	Consciot