Microscopía intravital de dos fotones de glioblastoma en un modelo murino

Resumen

Presentamos un enfoque novedoso para la microscopía de dos fotones de la administración tumoral de nanopartículas de óxido de hierro marcadas con fluorescencia al glioblastoma en un modelo de ratón.

Resumen

La administración de terapias contra el cáncer administradas por vía intravenosa a los tumores cerebrales está limitada por la barrera hematoencefálica. Un método para obtener imágenes directas de la acumulación y distribución de macromoléculas en tumores cerebrales in vivo mejoraría en gran medida nuestra capacidad para comprender y optimizar la administración de fármacos en modelos preclínicos. Este protocolo describe un método para el seguimiento in vivo en tiempo real de nanopartículas marcadas con fluorescencia administradas por vía intravenosa con microscopía intravital de dos fotones (2P-IVM) en un modelo de ratón de glioblastoma (GBM).

El protocolo contiene una descripción de varios pasos del procedimiento, que incluye la anestesia y analgesia de animales de experimentación, la creación de una ventana craneal, la implantación de células GBM, la colocación de una barra en la cabeza, la realización de estudios 2P-IVM y la atención posquirúrgica para estudios de seguimiento a largo plazo. Mostramos sesiones representativas de imágenes 2P-IVM y análisis de imágenes, examinamos las ventajas y desventajas de esta tecnología y discutimos las posibles aplicaciones.

Este método puede modificarse y adaptarse fácilmente a diferentes preguntas de investigación en el campo de las imágenes cerebrales preclínicas in vivo .

Introducción

La microscopía intravital de dos fotones (2P-IVM) es una técnica de imagen por fluorescencia que permite la visualización de tejido vivo¹.

Desarrollada por primera vez en la década de 1990, la 2P-IVM se ha utilizado para el análisis in vivo de la retina², el riñón³, el intestino delgado⁴, la cóclea⁵, el corazón⁶, la tráquea^{7 y el} cerebro en varios modelos preclínicos ^8,9. En el campo de la neurociencia, la 2P-IVM ha cobrado importancia como técnica para la obtención de imágenes en tiempo real del cerebro sano en animales despiertos¹⁰, así como para el estudio de enfermedades del sistema nervioso como el Alzheimer¹¹, el Parkinson¹² y el glioblastoma (GBM)13,14,15,16^.

2P-IVM ofrece una solución elegante para estudiar el microambiente tumoral durante el desarrollo de GBM. Mientras que algunos estudios anteriores se centraron en modelos in vitro¹⁷ y ex vivo ¹⁸, otros implementaron modelos ortotópicos¹⁹ y xenótropos²⁰ in vivo para examinar la GBM. Madden et al. realizaron imágenes nativas de la línea celular de glioma de rata SNC-1 en un modelo de ratón¹³. Utilizando un modelo murino ortotópico GL261-DsRed, Ricard et al. realizaron una administración intravenosa de un fluoróforo para mejorar los vasos sanguíneos en la región tumoral en 2P-IVM¹⁴.

Aquí, aplicamos 2P-IVM para rastrear la administración tumoral de nanopartículas de óxido de hierro (NP) marcadas con fluorescencia en un modelo de ratón ortotópico de GBM. Utilizando una ventana craneal, este método nos permite estudiar en detalle la distribución espacio-temporal en tiempo real de las NP en el cerebro.

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Protocolo

El procedimiento con animales descrito en este protocolo está de acuerdo con los requisitos del Panel Administrativo sobre el Cuidado de los Animales de Laboratorio (APLAC).

1. Cultivo celular

1. Preparación de la campana
   1. Lávese las manos, use guantes y una bata de laboratorio. Encienda el armario de seguridad biológica y ajuste el nivel de la hoja a una altura de apertura adecuada. Deje que la campana se purgue durante 3-5 minutos. Rocíe el área de la capucha con etanol al 70% y límpiela con papel de seda.
   2. Rocíe todos los reactivos con etanol al 70% y limpie con papel de seda. Mueva los reactivos a la campana. No coloque ningún artículo en la parrilla. Si se produce un derrame en la campana, cúbrala con toallitas, rocíela con etanol al 70% y vuelva a limpiar.
   3. Después del experimento, cierre con cuidado las tapas de cada artículo, limpie todos los materiales, retire los elementos de la campana y transfiéralos a su ubicación original. Rocíe etanol al 70% en la campana y límpiela. Cierre la hoja y apague el gabinete de seguridad biológica.
2. Preparación de un medio de cultivo
   1. Agregue 50 ml de suero bovino fetal (FBS) al 100% fetal (FBS) a 500 ml de medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco. Añadir 5 mL de la solución antibiótica-antimicótica (100x).
   2. Pasar todos los reactivos a través de un frasco filtrante estéril de 500 ml (filtro de 0,22 μm).
3. Descongelación de células criopreservadas
   1. En una campana de flujo laminar, agregue 20 ml del medio de crecimiento a un matraz T75. Etiquete el matraz con el nombre de las células, la fecha y el número de paso en el matraz. En este estudio, se utilizaron células de glioma C6 adherentes.
   2. Descongele las células rápidamente en un baño de agua a 37 °C. No haga vórtices en las células. Descongele e inmediatamente use las celdas.
   3. Transfiera las células descongeladas al matraz T75 con una punta de pipeta de 1 ml. Tenga cuidado de no introducir burbujas durante el proceso de transferencia y evite cualquier residuo medio en el cuello del matraz. Esto podría aumentar el riesgo de posible contaminación.
4. Cambiar el medio
   1. Cambie el medio al día siguiente de la descongelación para eliminar cualquier residuo de tripsina o dimetilsulfóxido (DMSO) (paso 1.6). Después, cambie el medio al menos dos veces por semana o más, dependiendo del nivel de confluencia celular. El medio debe cambiarse un día después del paso para eliminar la tripsina.
   2. Para cambiar el medio, encienda el aparato de aspiración, coloque la pipeta de vidrio de aspiración y aspire todo el medio.
   3. Añadir 20 ml del medio de cultivo (paso 1.2).
5. Pasar las células
   1. Cargue la campana con los elementos necesarios en el transcurso del experimento.
   2. Utilice una pipeta de vidrio de aspiración y aspire todos los medios, asegurándose de que la pipeta de vidrio esté en el lado no celular del matraz. Para este paso, coloque el matraz T75 verticalmente.
   3. Agregue ~ 10 ml de solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente (RT) (libre de PBS, Ca⁺⁺ y Mg⁺⁺ ) o solución salina balanceada de Hanks (libre de HBSS, Ca⁺⁺ y Mg⁺⁺ ) en el lado no celular. Lave las celdas brevemente con PBS colocando el matraz T75 horizontalmente con el lado de la celda hacia abajo.
   4. Coloque inmediatamente el matraz verticalmente y aspire el PBS/HBSS. Repetir este lavado y aspirar 3 veces.
   5. Añadir 2 ml de tripsina (recombinante o de origen animal) en el lado de la célula (matraz T75 horizontal, lado de la célula hacia abajo). Incubar en una incubadora de cultivo de tejidos estándar (37 °C, 5% CO₂) durante 4 min. Triturar una vez después de 2 minutos con una pipeta de 5 ml.
   6. Después de 4 min de incubación total, transfiera la solución a un tubo cónico de 15 mL. Añadir 8 mL de la solución de crecimiento al tubo cónico (2 mL de células tripsinizadas + 8 mL de medio = 10 mL en total).
   7. Utilice otro tubo cónico vacío de 15 ml con un filtro y transfiera las células a través de una pipeta de 25 ml para obtener células individuales.
   8. Transferir 1/10 (1 mL) de la solución (célula + medio + Tryp-LE) a un matraz T75 con 20 mL de medio. Alternativamente, cuente las celdas (paso 1.7). Cambie el medio al día siguiente para tener una solución de medios sin tripsina.
6. Congelar el medio y las células
   1. Descongele el 100% de FBS en un refrigerador a 4 °C. No use un baño de agua o calor, ya que esto puede dañar las proteínas en FBS.
   2. Para preparar 50 ml de medios de congelación, mezcle 45 ml de DMEM, 5 ml de FBS y 5 ml de DMSO. Alícuota a recipientes de 1-2 ml para evitar la descongelación intermitente y el daño de las proteínas. Guárdelos en el congelador a -20 ° o -80 ° C.
   3. Para los 9 ml restantes de solución (paso 1.5), agregue 1 ml de medio para alcanzar 10 ml en total. Centrifugar a 300 x g durante 4 min.
   4. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en 1 ml de medio de congelación (ver arriba). Coloque las células en un recipiente de congelación en un congelador a -80 °C. Mueva las células a N₂ líquido para su almacenamiento a largo plazo después de 1 o 2 días.
7. Contar las celdas
   1. Para los 9 ml restantes (paso 1.5), agregue 1 ml de medio hasta alcanzar los 10 ml en total. Centrifugar a 300 x g durante 4 min.
   2. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en 4 mL de HBSS. Resuspender 10 μL de células en 80 μL de HBSS + 10 μL de Azul de Tripano al 0,4%, factor de dilución = 10.
   3. Tome 17 μL de la solución y cuente cuatro cuadrados de 4 x 4 en un hemocitómetro. Cuenta el promedio de los cuatro cuadrados de 4 x 4 y multiplícalo por 10⁴x factor de dilución para obtener células/mL.

2. Cirugía

NOTA: Se recomienda realizar la cirugía por dos investigadores, donde una persona se encarga de preparar las células, mezclar el cemento dental y, en general, ayudar en el procedimiento, mientras que la segunda persona se enfoca en permanecer estéril. Tener un segundo manipulador para ayudar con el procedimiento quirúrgico reduce considerablemente la probabilidad de que ocurra contaminación. Seguir las mejores prácticas quirúrgicas reduciría las posibilidades de complicaciones postoperatorias. La Figura 1A proporciona una descripción general de los componentes de la ventana craneal.

1. Preparativos generales
   1. Confirme que el procedimiento está aprobado por las pautas institucionales locales de bienestar animal antes de comenzar.
      NOTA: En este estudio se utilizaron ratones hembra NSG de 5 meses de edad (NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) (n = 5).
   2. Antes de la cirugía, autoclave todos los instrumentos quirúrgicos y asegúrese de que todos los suministros necesarios estén disponibles. Imprima los registros de anestesia y cirugía.
   3. Asegúrese de que, a su llegada, los animales tengan al menos 1 semana de aclimatación a la sala de cría de animales para reducir la angustia postoperatoria adicional.
   4. El día de la cirugía, asegúrese de que todos los dispositivos (microscopio, almohadilla térmica, esterilizador, taladro, aspiradora, etc.) estén listos para usar. Confirme que la máquina de anestesia contiene suficiente isoflurano y rellene si es necesario. Para los nuevos usuarios, el procedimiento de la ventana craneal puede tardar hasta 2 h por animal; Por lo tanto, tener suficiente isoflurano es crucial.
   5. Coloque las ventanas de vidrio y las barras de cabecera en alcohol y prepare un recipiente con solución salina. Esto garantizará un flujo de trabajo fluido sin grandes brechas en la esterilidad y mantendrá el tiempo bajo anestesia para cada animal lo más corto posible.
   6. Abra todos los materiales quirúrgicos sobre una superficie estéril en la estación de trabajo. Por ejemplo, el interior de un envase de gasa estéril se puede utilizar para este propósito. Usa la técnica de solo puntas. Cuando no utilice instrumentos quirúrgicos, coloque las puntas sobre una superficie estéril, como el interior del envase de una gasa estéril.
   7. Al realizar múltiples cirugías, coloque todos los instrumentos quirúrgicos en el esterilizador entre cirugías para desinfectarlos. Cuando realice cirugías en más de 5 animales, utilice un nuevo conjunto de instrumentos esterilizados en autoclave. Cambie la punta de la broca cuando se rompa por una nueva para evitar traumatismos en los tejidos.
2. Anestesia y preparativos para la cirugía
   NOTA: La configuración de la anestesia es idéntica para la cirugía, así como para las imágenes.
   1. Anestesiar al ratón con isoflurano (3%-5% para inducción) en una cámara anestésica. Después de asegurar la profundidad anestésica adecuada probando el reflejo de retirada del pedal (pellizco de la almohadilla del pie en ambas patas traseras), transfiera al animal a una estación de trabajo de preparación. Mantener la anestesia sobre un cono de nariz (1%-2%). Aquí, aplique un ungüento para los ojos para prevenir daños en la córnea. Controle regularmente la pérdida de reflejos durante la cirugía comprobando el reflejo de la pata.
   2. Si se requiere alguna identificación del animal, use una herramienta de perforación de orejas o tijeras para marcar las orejas o use un marcador para marcar la cola.
   3. Retire el pelaje que cubre el cráneo entre las orejas y los ojos con una crema depilatoria. Dejar la crema el tiempo indicado (30-60 s) por el fabricante para evitar irritaciones en la piel. Asegúrese de que la crema entre en contacto con las raíces del cabello aplicándola en contra de la dirección del crecimiento del cabello. Evita que la crema depilatoria entre en contacto con los ojos. Retira la crema y los restos de cabello limpiando la zona con solución salina. Alternativamente, use maquinillas.
   4. Para evitar cualquier dolor, infección o hinchazón intra y postoperatoria, administre medicamentos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), opioides, agentes antiinflamatorios y antibióticos. Administrar carprofeno (5-20 mg/kg, subcutáneo [SQ]), buprenorfina de liberación sostenida (1 mg/kg SQ), cefazolina (20 mg/kg SQ) y dexametasona (0,2 mg/kg SQ) antes de la cirugía. Administrar aproximadamente 0,3 mL de solución salina al 0,9% SQ para evitar la deshidratación.
   5. A continuación, frote el área frotando alternativamente povidona yodada y alcohol isopropílico tres veces con movimientos circulares desde la mitad del cráneo hasta la periferia.
3. Procedimiento de craneotomía
   1. Transfiera el animal a la mesa quirúrgica y colóquelo en decúbito ventral sobre una almohadilla térmica (~37 °C) para garantizar las condiciones isotérmicas durante el procedimiento. La hipotermia en roedores reduce significativamente las tasas de supervivencia y prolonga la fase de recuperación postoperatoria.
   2. Coloque la cabeza en el marco estereotáxico colocando las barras de las orejas y las barras de los incisivos. Para las barras de las orejas, busque el arco cigomático e inserte las barras detrás de los arcos. Comience asegurando la barra contralateral con la mano dominante (por ejemplo, asegure la barra izquierda con la mano derecha si es diestro) y luego asegure el lado opuesto. Ajuste las posiciones de la oreja y las barras incisivas girando los tornillos si es necesario.
   3. Vuelva a aplicar el ungüento para los ojos si es necesario y use un trozo de papel de aluminio para cubrir los ojos. Esto evitará cualquier daño causado por la luz brillante del microscopio y la luz ultravioleta utilizada para curar el pegamento de cianoacrilato más adelante (paso 2.5).
   4. Antes de la incisión, verifique nuevamente el reflejo de pellizco del dedo del pie; Si es necesario, ajuste la anestesia en consecuencia. Conecte el animal al dispositivo de monitoreo de anestesia colocando el sensor en la pata trasera. La medición de la frecuencia cardíaca y la concentración de oxígeno en sangre ayudaría a reducir la mortalidad y mejorar la recuperación postoperatoria. Además, adquiera la frecuencia respiratoria inspeccionando visualmente el movimiento del pecho.
   5. Cubrir el cuerpo del animal con una cortina para evitar la hipotermia y la contaminación. Realice un hisopado final de povidona yodada antes de comenzar la cirugía.
   6. Póngase guantes y una bata de laboratorio limpia.
      NOTA: Se recomienda el uso de guantes estériles debido a lo invasivo del procedimiento y para reducir el riesgo de cualquier infección e inflamación postoperatoria que resulte en morbilidad y pérdida de calidad de imagen en 2P-IVM (sección 5).
   7. Levante la piel del cráneo y haga una incisión sosteniendo las tijeras entre el ojo derecho y la oreja y cortando hacia el lado izquierdo del cráneo siguiendo las marcas de incisión. Retire el colgajo de piel redondo resultante.
      NOTA: Dependiendo de la región de interés en el cerebro y del tamaño de la ventana, el sitio de la incisión y el diámetro pueden variar. El tamaño de la incisión debe ser mayor que el diámetro de la cabeza para acomodar el espacio para el montaje (paso 2.5). Si es necesario, la piel que rodea la incisión se puede diseccionar suavemente para crear más espacio.
   8. Retire el periostio rascando suavemente la superficie del cráneo con una hoja de bisturí o una microcureta. Tenga cuidado al retirar el periostio alrededor de las suturas craneales, ya que esas áreas son frágiles y más propensas al sangrado. Use solución salina y una aspiradora para mantener el área quirúrgica limpia de escombros. Rascar el periostio para asegurar una mejor adherencia al pegamento de cianoacrilato y al cemento dental (paso 2.5)
   9. Identificar la región del cerebro para realizar la inyección celular. Para ello, utilice un atlas de las coordenadas estereotácticas del cerebro del ratón. De acuerdo con las coordenadas cerebrales, marque la posición de la ventana craneal utilizando un punzón de biopsia del mismo diámetro que la ventana, un bolígrafo quirúrgico o un lápiz esterilizado en autoclave.
   10. Sostenga el taladro en la mano dominante y cualquier otro instrumento (jeringa, fórceps) en la mano no dominante. Evite perforar durante mucho tiempo en el mismo lugar. El taladro debe usarse en ráfagas para evitar el sobrecalentamiento. Durante estos descansos, aplique solución salina fría en la pantorrilla para mantener limpia la vista quirúrgica y evitar el sobrecalentamiento. Utilice la retroalimentación sensorial de la punta del taladro para detectar cuándo el cráneo se ha perforado por completo.
   11. Use solución salina fría, en combinación con una aspiradora, para limpiar la superficie del cráneo. No use gasa o un aplicador de punta de algodón después de abrir el calvario, ya que los restos de hilos de algodón pueden provocar una reacción de cuerpo extraño al sellar la ventana cerebral.
   12. Al perforar, asegúrese de que la trayectoria y el diámetro sean del mismo tamaño que los del cubreobjetos de vidrio. Para ello, coloque el cubreobjetos de vidrio en la parte superior del cráneo y confirme que el cubreobjetos de vidrio encajará exactamente dentro de la ventana craneal.
   13. Una vez que sea posible deprimir el colgajo de cráneo presionando suavemente sobre él, use fórceps para extraer cuidadosamente el fragmento del campo quirúrgico (Figura 1B, izquierda). Si aún no es posible deprimir el cráneo, continúe perforando en las áreas de la ventana craneal que aún están conectadas con el resto del cráneo y reevalúe.
   14. Si se produce una hemorragia leve, use una esponja hemostática combinada con una ligera presión o, alternativamente, solución salina helada, para ayudar a reducir la pérdida de sangre.
4. Implantación celular
   1. Prepare y cuente las células que se van a implantar como se describe en el paso 1.7. Asegúrese de que el número de células sea de 200.000 células/μL.
      NOTA: Se recomienda suspender las células en una matriz de membrana que se solidifique en RT. Esto mejorará la tasa de éxito de las células implantadas en el parénquima cerebral.
   2. Transfiera las células en un recipiente con hielo al quirófano. Use una jeringa hermética de microlitros. Antes de la aspiración, mantenga la jeringa en hielo para evitar diferencias de temperatura.
   3. Después de aspirar 1 μL, coloque la jeringa dentro del marco estereotáxico.
      NOTA: Se puede utilizar un dispositivo automatizado de coordenadas estereotácticas que muestra las posiciones en los ejes X, Y y Z para ahorrar tiempo. También es posible calcular manualmente las posiciones en función de lambda. No se recomienda inyectar más de 1,5 μL. Esto asegurará que el área inyectada no se llene en exceso, causando una implantación fallida, crecimiento fuera del parénquima cerebral o metástasis.
   4. Realizar la implantación en la región V2MM (corteza visual 2, parte mediomedial) del cerebro, que corresponde aproximadamente de medial a lateral (M-L): -1,2 a -1,6 mm, y dorsal a ventral (D-V): coordenadas de -2,6 a -3,5 mm.
      1. Para obtener imágenes de dos fotones (paso 4.6), implante las células en las áreas superficiales del cerebro para que la masa tumoral pueda visualizarse a través de la ventana craneal más adelante. Inyectar 0,5 μL (100.000 células) de cara anterior a posterior (A-P): 0,8 mm de profundidad. Mueva la aguja lentamente, de manera escalonada, al entrar en el cerebro y espere 30 s después de la inyección (Figura 1B, columna central).
      2. Use el mismo enfoque cuando retraiga la aguja y salga del tejido cerebral. Evite inyectar cerca de los ventrículos, ya que el líquido cefalorraquídeo podría favorecer la metástasis en los sistemas nerviosos central y periférico.
5. Cierre de la ventana craneal
   1. Mueva la barra de cabecera y el cubreobjetos de vidrio del alcohol a una solución salina. Use una punta de vacío o fórceps para llevar esos componentes al sitio quirúrgico.
   2. Coloque el cubreobjetos de vidrio dentro de la ventana craneal y coloque una pequeña cantidad de pegamento de cianoacrilato entre el cráneo y el cubreobjetos de vidrio. El pegamento de cianoacrilato activado por UV reduce el tiempo de curado y evita el desplazamiento accidental. Si se derrama pegamento en el cubreobjetos de vidrio, retírelo con un aplicador de punta de algodón o raspándolo suavemente con el lado romo de un bisturí antes de que se cure por completo.
      PRECAUCIÓN: La luz ultravioleta es dañina para los ojos y la piel. Evite el contacto con los ojos y la piel mientras cura el pegamento.
   3. Después de asegurar el cubreobjetos de vidrio en la ventana craneal, aplique la barra de cabeza. Mezcle el cemento dental de dos componentes, coloque la barra de cabeza y aplique el cemento en el área circundante, asegurando el contacto entre el cráneo y la barra de cabeza. Limpie cuidadosamente cualquier cemento superfluo con la punta de una jeringa, un bisturí o una punta de taladro.
      NOTA: El cemento dental se solidifica muy rápidamente, por lo que se aconseja aplicarlo de manera oportuna.
   4. Después de sellar la ventana craneal, identifique si alguna área del cráneo entre el cemento dental y la piel todavía está expuesta. Si ese es el caso, aplique pegamento quirúrgico para cubrir el cráneo cerrando la piel. Alternativamente, realice una sola sutura con un material de sutura absorbible.

3. Recuperación postquirúrgica y crecimiento tumoral

1. Recuperación
   1. Vigile al animal en una almohadilla térmica en una jaula de recuperación hasta que recupere la conciencia total. Aloje a los animales por separado después de la cirugía para reducir el riesgo de lesiones.
   2. Administre una dieta de recuperación, como geles de agua disponibles comercialmente con electrolitos o azúcares. Alternativamente, suministre comida de laboratorio estándar humedecida para garantizar una nutrición fácil y evitar la deshidratación y la hipoglucemia.
2. Monitorización
   1. Una vez recuperado, vigile al animal diariamente para detectar signos de dolor, angustia o infección. Si es necesario, administre analgésicos, antiinflamatorios o antibióticos. Si un animal alcanza el criterio de valoración del estudio, eutanasiarlo de forma humanitaria. Después de la sesión final de imágenes, se practica la eutanasia al ratón mediante asfixia con dióxido de carbono, seguida de una luxación cervical.
      NOTA: Los ejemplos de criterios de eutanasia temprana incluyen, entre otros, pérdida de peso significativa (>20%), trastornos neurológicos, disnea, sangrado excesivo durante la cirugía o comportamiento estereotipado pronunciado. Inspeccione la ventana craneal y límpiela con solución salina o alcohol cuando sea necesario.
   2. Para realizar un seguimiento del crecimiento tumoral y planificar los puntos temporales de las imágenes, realice imágenes de bioluminiscencia (BLI) de todo el cuerpo. Para ello, inyectar 150 mg/kg de D-luciferina por vía intraperitoneal e obtener imágenes del animal después de 5-15 min.

4. Síntesis de nanopartículas

1. Preparación de partículas
   1. Añadir 11,17 mL de Ferumoxitol (6 mmol de Fe en total) a una solución que contenga 50 mL de NaOH 5M, 20 mL de agua desionizada (agua desionizada) y 20 mL de epiclorhidrina. Observe la segregación de fases en esta etapa. Incubar la mezcla en RT bajo una suave agitación durante 24 h.
   2. Después de 24 h, la solución se vuelve uniforme. Elimine el exceso de epiclorhidrina utilizando un tubo de diálisis (corte de 12.000-14.000 Da) contra el agua durante 3 días.
   3. Después de la diálisis, transfiera la solución restante en el tubo a un frasco de vidrio (volumen total ~ 110 ml). Añadir 30 mL de hidróxido de amoníaco y agitar la mezcla a 37 °C durante 18-20 h.
   4. Después de agitar, repita la diálisis contra el agua durante 3 días. Transfiera la solución restante en el tubo de diálisis a un nuevo frasco de vidrio con un volumen total de ~110 ml.
2. Conjugación de isotiocianato de fluoresceína (FITC)
   1. Extraiga 27,5 ml de partículas funcionalizadas con aminas para la conjugación de FITC. Concentrar las partículas con un filtro de ultracentrifugación de 10 kDa y lavar con un tampón de pH 9 (Na₂CO₃/NaHCO₃) a 5752 x g a 25 °C durante 10 min.
   2. Añadir 4 ml de la solución en el filtro y ultracentrifugar el tubo a 5752 x g a 25 °C durante 10 min. Deseche el filtrado y vuelva a llenar el filtro con tampón para una segunda ronda de lavado con el mismo protocolo.
   3. Deseche el filtrado y recoja la solución en el filtro con una pipeta. Estime la concentración molar de la partícula por la concentración de masa de Ferumoxytol, suponiendo que el diámetro de cada partícula es de 5 nm.
   4. Disolver FITC en dimetilsulfóxido anhidro (DMSO) a 10 mg/mL. Agregue lentamente 1,4 ml de FITC disuelto en DMSO a la partícula concentrada funcionalizada con aminas. La relación molar de FITC: partícula es de 20:1. A continuación, incubar la solución a 4 °C durante 8 h en la oscuridad.
   5. Apague la reacción agregando exceso de NH₃. H₂O (la concentración final de NH₃. H₂O es 50 mM), luego dejar que la solución permanezca a 4 °C en la oscuridad durante 2 h. Lavar el exceso de FITC con tampón Na₂CO₃/NaHCO₃ (pH 9) a través de un filtro de 10 kDa a 5752 x g a 25 °C durante 10 min. El pH final de la solución se ajusta a 7,4 utilizando una solución acuosa de HCl.

5. 2P-IVM

NOTA: Para las sesiones 2P-IVM, se utilizó un microscopio Prairie Ultima IV con una platina personalizada (Figura 2 y Archivo de Codificación Suplementario 1) que permite ajustar la posición de la ventana craneal horizontal y verticalmente. Se utilizó el software Fiji para el posprocesamiento y el análisis de imágenes. De esta manera, el rayo láser se puede ajustar para golpear el vidrio en un ángulo de 90 °, lo que reduce los artefactos y mejora la calidad de la imagen.

1. Sesión de imágenes
   1. Encienda el láser Ti-Sapphire. Encienda el interruptor principal del sistema y el software Prairie View.
   2. Anestesiar al animal, como se ha descrito anteriormente (paso 2.2). Realizar sesiones de imagen de hasta 2 h por animal. Mantenga el tiempo de obtención de imágenes al mínimo para reducir el riesgo de complicaciones de la anestesia y la morbilidad o mortalidad asociada.
   3. Inmovilice el ratón bajo el microscopio de dos fotones utilizando una platina personalizada (Figura 1B, columna derecha). Coloque al animal en posición prona sobre una almohadilla térmica diseñada para la cirugía de roedores y asegúrelo ligeramente con cinta adhesiva mientras presta atención a no contraer el tórax. Coloque una gota de agua en la ventana craneal y ajuste el enfoque.
   4. Adquirir la frecuencia cardíaca y la oxigenación de la sangre para controlar los parámetros vitales de los animales. Coloque el sensor en la pata trasera y mantenga el dispositivo de monitoreo fuera de la cámara de imágenes de dos fotones.
   5. Una vez que el animal esté en la platina del microscopio, ajuste la posición de la cabeza. Con los binoculares y la iluminación fluorescente de campo amplio, configure el filtro de proteína fluorescente roja (RFP) y encuentre el campo de visión de imagen deseado (Figura 1B, columna derecha).
   6. Una vez que se determinan la orientación de la muestra y el campo de visión, cambie el microscopio del modo de campo amplio al modo de microscopía de barrido con luz (LSM).
   7. Asegúrese de que el láser Ti-Sapphire esté bloqueado en modo a 920 nm y que todos los obturadores estén abiertos. Lleve los voltajes de los detectores de tubos fotomultiplicadores (PMT) de GaAsP a 500-600 V. Utilice dos PMT con juegos de filtros con pasos de banda a 595/50 (RFP) y 525/50.
   8. Presione Live Image y modifique lentamente la celda de pockel para aumentar la potencia del láser en la muestra hasta que se vea una imagen.
   9. Una vez que se logra una imagen clara, utilice el software y la platina motorizada para establecer la parte superior e inferior de una pila de imágenes dentro del área de muestra deseada. Tenga cuidado con el tamaño del paso y tenga en cuenta que el eje Z ajusta la profundidad de la lente.
   10. A medida que aumenta la profundidad, las imágenes se oscurecerán. Aumente la ganancia de pockels/PMT lentamente para mantener la imagen brillante. Tenga cuidado de no usar demasiada energía, ya que puede provocar fototoxicidad y daño tisular.
   11. Establezca una ruta de guardado e inicie la serie Z. Se desplazará automáticamente a las posiciones inicial y final utilizando la configuración establecida de pockel/PMT. Una vez que la pila esté completa, use la reproducción para revisar la calidad de la pila. Una vez que se complete la adquisición de las imágenes necesarias, apague el láser Ti-Sapphire.
   12. Traslade al animal a una jaula de recuperación, como se ha descrito anteriormente (paso 3.1).
   13. Salga de la vista de la pradera y asegúrese de que todos los datos se guarden/transfieran. Apague la computadora y apague todo el hardware.
2. Post-procesamiento con FIJI
   NOTA: Fiji es un software de código abierto centrado en el análisis de imágenes biológicas²¹.
   1. Descargue FIJI con respecto al sistema operativo. Descomprima el contenido de la carpeta y ejecute el archivo .exe.
   2. Arrastre el archivo .env recopilado de la imagen de dos fotones al cuadro de diálogo. Divida los canales en diferentes cuadros de imagen. Esto creará dos imágenes diferentes con diferentes canales, uno que contiene la señal de la célula y el otro la señal de partículas.
   3. Copie una de las imágenes y haga clic en Archivo > Nuevo > Portapapeles Interno para crear otra imagen. Cambie el nombre de una de las imágenes a Origen y a la otra a Copia.
   4. Utilice la imagen copiada y haga clic en Procesar > Mejorar contraste en el cuadro de diálogo. Haga clic en Normalizar y Aceptar y, a continuación, en Procesar > suavizar. Esta imagen se utiliza para crear una máscara y no para el análisis. Haga clic en Imagen > Ajustar > umbral en el cuadro de diálogo. Utilice la escala deslizante y el método que sea adecuado para extraer y, a continuación, haga clic en Aplicar.
   5. Utilice Procesar > Binario > Erosionar para erosionar píxeles individuales en el fondo y haga clic en Procesar > Binario > Dilatar para volver a agregar píxeles a la imagen.
   6. Haga clic en Procesar > calculadora de imágenes en el cuadro de diálogo, seleccione la imagen de origen como la primera y seleccione la segunda imagen como Copiar. Utilice AND para crear la intersección de ambas imágenes. Repita el mismo paso para la imagen del otro canal.
   7. Para el análisis de señales fuera de la región vascular, abra una imagen copiada sin alterar y elimine el área vascular de la señal con la herramienta ROI a mano alzada.
   8. Establezca los parámetros deseados yendo a Analizar > Establecer medidas. Asegúrese de que el Área, la Densidad integrada y el Valor medio de gris estén marcados.
   9. Ahora analice mediante Analizar > medir. Aparecerá una ventana con las medidas. Copie los datos en una hoja de cálculo.
   10. Ahora seleccione un área pequeña de la imagen que no tenga fluorescencia. Este será el antecedente.
   11. Haga clic en Analizar > medida para esa región. Copie los datos en una hoja de cálculo.
   12. Guarde la imagen resultante como Archivo > Guardar como > tipo de archivo Analizar para volver a medir o con fines de publicación.

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Resultados

Aquí, realizamos una cirugía de ventana craneal e injertamos células C6 en un modelo de ratón NSG de GBM (n = 5). Un sellado adecuado entre todos los componentes involucrados en la creación de la ventana (Figura 1A) garantizará la durabilidad de las ventanas para la obtención de imágenes a largo plazo y, además, reducirá la morbilidad. Utilizando la platina adaptada para 2P-IVM in vivo (Figura 2), pudimos obtener imágenes de animales bajo ane...

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Discusión

Presentamos un método para el seguimiento in vivo de NP en tiempo real utilizando 2P-IVM a través de una ventana craneal para evaluar la administración tumoral de NP de óxido de hierro marcadas con fluorescencia. La técnica quirúrgica para este procedimiento requiere una mano firme y habilidades quirúrgicas experimentales avanzadas. Es recomendable practicar el uso de cadáveres o fantasmas antes de pasar a la experiencia con animales vivos. Como alternativa, Hoeferlin et al. implementaron un taladro rob?...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride infusion solution	Baxter Corp	533-JB1301P
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
1 mL syringes	BD	Luer-Lok syringe, REF309628
10% FBS	Thermo fisher	Cytiva SH30910.03HI
10% DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
2-photon microscope	Prairie Technologies, Bruker	Prairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%	Medline Industries, LP	MDS093810
Alcohol, spray bottle	Decon Labs Inc	Decon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foil	Reynold Brands	Reynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machine	Patterson Scientific	SAS3
Anesthesia monitoring	Kent Scientific	MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid	Invitrogen	15240-096
Betadine applicators	Professional Disposables International, Inc	S41125
Biopsy punch, 5 mm	Miltex	Size 5
Buprenorphine sustained release	Zoo Pharm	Bup SR Lab, 1.0 mg/mL	A generic drug can be used instead.
C6 rat glioma cell line	ATCC (American Tissue Culture Collection)	CCL-107
Cannulas	BD	16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
Carprofen	Pfizer	Rimadyl, 50 mg/ml	A generic drug can be used instead.
Cefazoline	Sagent Pharmaceuticals	25021-101-10, 1 g/vial	A generic drug can be used instead.
Cell strainer, 40 µm	Fisher Scientific	87711
Cotton tip applicators, 6”	Dyad Medical Sourcing, LLC	HCS1005
Dental cement	Stoelting Co	51459	Dental cement kit, clear, 2 components
Dexamethasone	Bimeda	138RX, 2 mg/mL	A generic drug can be used instead.
DietGel	ClearH2O	Recovery, 72-06-502
Drape	Cardinal Health	Bio Shield Wrap
Drill	Saeyang Microtech	Escort Pro, B08350
Drill tips	Hager & Meissinger GmbH	REF310104001001005	Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis software	National Institute of Health	https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Fisher Scientific	13-812-41
Gauze	Fisher HealthCare	Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam	Ethicon Inc.	Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator	Cellpoint Scientific	Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameter	Fisher Scientific	Menzel Cover glass
Gloves, non-sterile	Fisher Scientific	Nitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterile	Medline Industries, LP	MDS104070
Hair removal cream	Church & Dwight	Nair Hair remover lotion
Hamilton syringe	Hamilton Company Inc	Gastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, Mg	Fisher Scientific	PI88284
Head bar	Hongway	5 mm inner diameter O-rings
Heating pad	Stoelting Co.	Rodent warmer X2
Insulin syringes	Exel International Medical Products	29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticles	Covis Pharma GmbH	Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
Isoflurane	Dechra	26675-46-7
Mice	Jackson Laboratories	NSG, Strain 005557
Microscope (surgery)	Seiler Medical	Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticles	Custom		Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointment	Major pharmaceuticals	Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
Oxygen	Linde Gas & Equipment Inc.	High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cups	Georgia-Pacirif Consumer Products	Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubing	Braintree Scientific	50-195-5494
Scale	Ohaus Corp	CR2200
Scalpel	Integra Life Sciences Production Corp	Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel
Scissors	Fisher Scientific	13-804-18
Sealant	Henkel Corp	Loctite 4014
Single use lab gown	High Tech Conversions	17-444-081
Stereotactic frame	Stoelting Co.	Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems	Fisher Scientific	S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam box	N/A	N/A
Surgical gloves	Cardinal Health	19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive	3M Animal Care Prodcuts	1469SB
Tail vein cathether	Custom		Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing
TrypLE Express (1x), no phenol red	Invitrogen	12604-039
Ultraviolett torch	Spring sunshine technology	Consciot