Un enfoque de clonación sin fisuras para la construcción de vectores de expresión del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para obtener el vector de expresión pVAX1-PRRSV mediante la introducción de sitios de restricción adecuados en el extremo 3' de los insertos. Podemos linealizar el vector y unir fragmentos de ADN al vector uno por uno mediante la tecnología de recombinación homóloga.

Resumen

La construcción de vectores de expresión génica es un componente importante del trabajo de laboratorio en biología experimental. Con avances técnicos como el ensamblaje de Gibson, la construcción vectorial se vuelve relativamente simple y eficiente. Sin embargo, cuando el genoma completo del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) no puede amplificarse fácilmente mediante una sola reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ADNc, o es difícil adquirir un vector de expresión génica de longitud completa mediante la recombinación homóloga de múltiples inserciones in vitro, la técnica actual de ensamblaje de Gibson no logra este objetivo.

En consecuencia, nos propusimos dividir el genoma del PRRSV en varios fragmentos e introducir sitios de restricción apropiados en el cebador inverso para obtener fragmentos amplificados por PCR. Después de unir el fragmento de ADN anterior en el vector mediante tecnología de recombinación homóloga, el nuevo vector adquirió el sitio de escisión de la enzima de restricción. Por lo tanto, podemos linealizar el vector utilizando el sitio de escisión de la enzima recién agregado e introducir el siguiente fragmento de ADN aguas abajo del fragmento de ADN aguas arriba.

Se eliminará el sitio de escisión de la enzima de restricción introducido en el extremo 3' del fragmento de ADN aguas arriba, y se introducirá un nuevo sitio de escisión en el extremo 3' del fragmento de ADN aguas abajo. De esta forma, podemos unir fragmentos de ADN al vector uno a uno. Este método es aplicable para construir con éxito el vector de expresión PRRSV y es un método eficaz para ensamblar un gran número de fragmentos en el vector de expresión.

Introducción

Como técnica esencial para construir herramientas experimentales basadas en ADN para su expresión en células procariotas y eucariotas, la clonación molecular es un componente muy importante de la biología experimental. La clonación molecular implica cuatro procesos: la adquisición del ADN del inserto, la ligadura del inserto en el vector apropiado, la transformación del vector recombinante en Escherichia coli (E. coli) y la identificación de los clones positivos¹. Hasta ahora, se han adoptado múltiples métodos para unir moléculas de ADN mediante el uso de enzimas de restricción ^2,3

Protocolo

1. Preparación de la plantilla del gen PRRSV

1. Descongele el stock de virus en 1 mL de reactivo de extracción de ARN (consulte la tabla de materiales).
2. Añadir 0,2 mL de cloroformo y mezclar bien. Incubar durante 3 min.
3. Centrifugar la mezcla durante 15 min a 12.000 × g a 4 °C.
   NOTA: La mezcla se divide en tres fases, a saber, una fase acuosa incolora, una interfase y una fase de fenol-cloroformo rojo.
4. Pipetear la fase acuosa incolora y transferirla a un nuevo tubo.
5. Mezclar bien la fase acuosa con 0,5 mL de isopropanol e incubar durante 10 min a 4 °C.
6. Centrifugar dura....

Discusión

La técnica de ensamblaje de Gibson es un método de clonación molecular basado en la recombinación in vitro para el ensamblaje de fragmentos de ADN⁸. Este método permite el ensamblaje de múltiples fragmentos de ADN en un plásmido circular en una reacción isotérmica de un solo tubo. Sin embargo, uno de los obstáculos para la técnica de ensamblaje de Gibson es la adquisición de fragmentos largos de ADNc. Los fragmentos largos son difíciles de amplificar con precisión por muchas.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb plus DNA Ladder	Tiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., Ltd	MD113-02
2x Universal Green PCR Master Mix	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A303-1
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	9012-36-6
Benchtop Microcentrifuge	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FRESCO17
Clean Bench	Sujing Antai Air Technology  Co., Ltd	VD-650-U
DNA Electrophoresis Equipment	Cleaver Scientific  Co., Ltd	170905117
DNA Loading Buffer (6x)	Biosharp Biotechnology Co., Ltd	BL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kit	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit I	Omega Bio-Tek Co., Ltd	D6943-01
Electro-heating Standing-temperature Cultivator	Shanghai Hengyi Scientific Instrument Co., Ltd	DHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kit	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNase	Rong Wei Gene Biotechnology Co., Ltd	A502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0303
FastDigest HindIII	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0504
FastDigest NheI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0974
FastDigest NotI	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	FD0596
Gel Doc XR	Bio-Rad Laboratories Co., Ltd	721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel Stain	Shanghai Yubo Biotechnology Co., Ltd	YB10201ES03
Ice Maker Machine	Shanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., Ltd	FMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B540113-0001
Micropipettors	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	—
Microwave Oven	Panasonic Electric (China) Co., Ltd	NN-GM333W
Orbital Shakers	Shanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., Ltd	ZHWY-2102C
PRRSV virus	Sichuan Agricultural University	—
SnapGene	GSL Biotech, LLC	v5.1	To design primers
T100 PCR Gradient Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories  Co., Ltd	T100 Thermal Cycler
TAE buffer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	B040123-0010
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific  Co., Ltd	15596026	RNA extraction reagent