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  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para obtener el vector de expresión pVAX1-PRRSV mediante la introducción de sitios de restricción adecuados en el extremo 3' de los insertos. Podemos linealizar el vector y unir fragmentos de ADN al vector uno por uno mediante la tecnología de recombinación homóloga.

Resumen

La construcción de vectores de expresión génica es un componente importante del trabajo de laboratorio en biología experimental. Con avances técnicos como el ensamblaje de Gibson, la construcción vectorial se vuelve relativamente simple y eficiente. Sin embargo, cuando el genoma completo del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) no puede amplificarse fácilmente mediante una sola reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir del ADNc, o es difícil adquirir un vector de expresión génica de longitud completa mediante la recombinación homóloga de múltiples inserciones in vitro, la técnica actual de ensamblaje de Gibson no logra este objetivo.

En consecuencia, nos propusimos dividir el genoma del PRRSV en varios fragmentos e introducir sitios de restricción apropiados en el cebador inverso para obtener fragmentos amplificados por PCR. Después de unir el fragmento de ADN anterior en el vector mediante tecnología de recombinación homóloga, el nuevo vector adquirió el sitio de escisión de la enzima de restricción. Por lo tanto, podemos linealizar el vector utilizando el sitio de escisión de la enzima recién agregado e introducir el siguiente fragmento de ADN aguas abajo del fragmento de ADN aguas arriba.

Se eliminará el sitio de escisión de la enzima de restricción introducido en el extremo 3' del fragmento de ADN aguas arriba, y se introducirá un nuevo sitio de escisión en el extremo 3' del fragmento de ADN aguas abajo. De esta forma, podemos unir fragmentos de ADN al vector uno a uno. Este método es aplicable para construir con éxito el vector de expresión PRRSV y es un método eficaz para ensamblar un gran número de fragmentos en el vector de expresión.

Introducción

Como técnica esencial para construir herramientas experimentales basadas en ADN para su expresión en células procariotas y eucariotas, la clonación molecular es un componente muy importante de la biología experimental. La clonación molecular implica cuatro procesos: la adquisición del ADN del inserto, la ligadura del inserto en el vector apropiado, la transformación del vector recombinante en Escherichia coli (E. coli) y la identificación de los clones positivos1. Hasta ahora, se han adoptado múltiples métodos para unir moléculas de ADN mediante el uso de enzimas de restricción 2,3 y recombinación mediada por PCR 4,5,6. La recombinación homóloga, conocida como tecnología de clonación sin fisuras, es el grupo de métodos de clonación que permite la inserción independiente de la secuencia y sin cicatrices de uno o más fragmentos de ADN en un vector. Esta tecnología incluye la clonación independiente de la secuencia y la ligadura (SLIC), el extracto de clonación de ligadura sin costuras (SLiCE), la infusión y el ensamblaje de Gibson. Emplea una exonucleasa para degradar una hebra del inserto y un vector para generar extremos cohesivos, y reparación in vivo o recombinación in vitro para unir covalentemente el inserto al vector formando enlaces fosfodiéster. La capacidad de unir un solo inserto a un vector en cualquier secuencia sin cicatrices es muy atractiva. Además, la tecnología tiene la capacidad de unir de 5 a 10 fragmentos en un orden predeterminado sin restricciones de secuencia.

Como una de las muchas técnicas de ADN recombinante, la técnica de ensamblaje de Gibson, actualmente el método de clonación más eficaz 7,8, es un método robusto y elegante basado en exonucleasas para ensamblar uno o varios fragmentos de ADN linealizados sin problemas. La reacción de ensamblaje de Gibson se realiza en condiciones isotérmicas utilizando una mezcla de tres enzimas, a saber, 5' exonucleasa, polimerasa de alta fidelidad y una ADN ligasa termoestable. Los salientes de una sola cadena 3' creados por la exonucleasa 5'-3' contribuyen al recocido de fragmentos que comparten complementariedad en un extremo. La polimerasa de alta fidelidad llena eficazmente los huecos en las regiones de una sola cadena recocidas mediante la adición de dNTP, y la ADN ligasa termoestable sella las muescas para formar moléculas de ADN conjuntas8. De ahí que este método técnico haya sido ampliamente utilizado para la construcción de vectores de expresión génica.

El síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRS, por sus siglas en inglés) es una enfermedad viral que provoca deterioro reproductivo e insuficiencia respiratoria en cerdos causada por el PRRSV a cualquier edadde 9 años. El síndrome se manifiesta como fiebre, anorexia, neumonía, letargo, depresión y dificultad respiratoria. Además, en algunas epidemias se han observado signos clínicos, como la decoloración roja/azul de las orejas. Como miembro de la familia de los arterivirus, el PRRSV se transmite ampliamente a los países productores de carne de cerdo por contacto directo e intercambio de fluidos, como orina, calostro y saliva. Debido a la propagación del PRRSV en los Estados Unidos, las pérdidas económicas totales de la industria porcina se han estimado en aproximadamente 664 millones de dólares por año, sobre la base de la escala de cría de 5,8 millones de cerdas y 110 millones de cerdos10,11. El informe del Servicio de Inspección de Sanidad Agropecuaria muestra que el 49,8% de los cerdos no vacunados muestran la presencia de PRRSV en suero12 y los niveles bajos de PRRSV en cerdos infectados se excretan a través de la saliva, las secreciones nasales, la orina y las heces13. Se han implementado múltiples estrategias para controlar la propagación del PRRSV 14,15,16. Además de los procedimientos de eliminación para crear poblaciones completamente negativas para el virus o mejorar la bioseguridad y la gestión, la administración de vacunas es un medio eficaz para controlar el PRRS.

El PRRSV es un virus de ARN monocatenario con envoltura y sentido positivo con una longitud de aproximadamente 15 kilobases (kb). El genoma del PRRSV consta de al menos 10 marcos de lectura abiertos (ORF), una región corta no traducida de 5' (5' UTR) y una cola de poli(A) en el extremo 3' (Figura 1A)17. El genoma de un virus de ARN de cadena negativa no es infeccioso, mientras que el genoma de los virus de ARN de cadena positiva es infeccioso. Existen dos estrategias principales para la transfección de ARN y ADN para generar la progenie del virus18. Sin embargo, la clonación del fragmento completo correspondiente al genoma de ARN es crucial para la construcción de clones infecciosos. Debido a la naturaleza larga y compleja del genoma del PRRSV, el genoma completo no se puede obtener fácilmente mediante PCR de una sola vez. Además, aunque la síntesis artificial de genes PRRSV es una solución eficaz, la síntesis de fragmentos largos suele ser costosa. Por lo tanto, para obtener el vector de expresión de longitud completa PRRSV, intentamos crearlo mediante el método de recombinación homóloga de inserciones múltiples19,20. Desafortunadamente, no pudimos obtener el vector de expresión génica de longitud completa. Por lo tanto, en este estudio, añadimos sitios de restricción apropiados al cebador inverso y obtuvimos con éxito el vector de expresión pVAX1-PRRSV mediante varias rondas de reacciones de recombinación homólogas. Además, este método también puede lograr la deleción o mutación de genes objetivo y unir de manera eficiente un gran número de fragmentos de ADN al vector de expresión.

Protocolo

1. Preparación de la plantilla del gen PRRSV

  1. Descongele el stock de virus en 1 mL de reactivo de extracción de ARN (consulte la tabla de materiales).
  2. Añadir 0,2 mL de cloroformo y mezclar bien. Incubar durante 3 min.
  3. Centrifugar la mezcla durante 15 min a 12.000 × g a 4 °C.
    NOTA: La mezcla se divide en tres fases, a saber, una fase acuosa incolora, una interfase y una fase de fenol-cloroformo rojo.
  4. Pipetear la fase acuosa incolora y transferirla a un nuevo tubo.
  5. Mezclar bien la fase acuosa con 0,5 mL de isopropanol e incubar durante 10 min a 4 °C.
  6. Centrifugar durante 10 min a 12.000 × g a 4 °C.
    NOTA: La parte inferior del tubo tiene un precipitado de ARN blanco.
  7. Utilice una micropipeta para desechar el sobrenadante del tubo.
  8. Agregue 1 mL de etanol al 75% para resuspender brevemente el pellet y el vórtice.
  9. Centrifugar durante 5 min a 7.500 × g a 4 °C. Utilice una micropipeta para desechar el sobrenadante del tubo.
  10. Seque el ARN durante 5 minutos, agregue 20-50 μL de agua libre de ARNasa para resuspender el ARN y mezcle bien.
  11. Proceda a realizar la transcripción inversa; configure las reacciones para realizar la transcripción inversa como se muestra en la Tabla 1.
    NOTA: Para garantizar el éxito de la transcripción inversa, utilice plantillas de ARN de alta calidad.
  12. Utilice el ADNc resultante para PCR o guárdelo a -20 °C.

2. Diseño del cebador PCR

  1. Diseño de la imprimación delantera
    1. Abra el software y elija Nuevo archivo de ADN.
    2. Pegue la secuencia del gen PRRSV (GenBank: FJ548852.1) del NCBI en el software. Haga clic en Aceptar para generar los archivos de secuencia.
    3. Analice la secuencia y marque las uniones de fragmentos. Diseñe el cebador de secuencia específica hacia adelante de los fragmentos. Para la mayoría de los casos, la temperatura de fusión preferible (Tm) está entre 55 °C y 62 °C, y el contenido de GC es del 40-60%.
    4. Haga clic en Imprimaciones y elija Agregar imprimación.
    5. Pegue la secuencia específica y agregue secuencias superpuestas del vector al primer nucleótido 5' del cebador de secuencia específica. Cerca de cada cruce, elija 20-40 pb para que sirva como región de superposición entre los dos fragmentos adyacentes.
    6. Asigne un nombre al cebador delantero que contiene los voladizos y la secuencia específica (consulte la Figura complementaria S1).
    7. Haga clic en Agregar imprimación a la plantilla.
  2. Diseño de la imprimación inversa
    1. Analice la secuencia y marque las uniones de fragmentos en el software. Diseñe el cebador de secuencia específica inversa de los fragmentos.
    2. Haga clic en Imprimaciones y elija Agregar imprimación.
    3. Pegue la secuencia específica y agregue el sitio de restricción al primer nucleótido 5' del cebador de secuencia específica.
      NOTA: Los sitios de restricción agregados deben estar ausentes del fragmento de inserción y del vector, excepto en los sitios de clonación múltiples.
    4. Agregue secuencias de voladizo de vectores de 20 a 40 pb al primer nucleótido 5' del sitio de restricción.
    5. Asigne un nombre al cebador inverso que contiene los voladizos y la secuencia específica (consulte la Figura complementaria S1).
    6. Haga clic en Agregar imprimación a la plantilla.

3. PCR para amplificar fragmentos

  1. Configure seis reacciones individuales de PCR (Tabla 2): para el fragmento 1, utilice los cebadores P1 y P2 (véase la Figura complementaria S2); para el fragmento 2, utilice los cebadores P3 y P4 (véase la Figura Suplementaria S2); para el fragmento 3, utilice los cebadores P5 y P6 (véase la Figura Suplementaria S2); para el fragmento 4, utilice los cebadores P7 y P8 (véase la Figura Suplementaria S2); para el fragmento 5, utilice los cebadores P9 y P10; y utilice los cebadores P11 y P12 para amplificar el fragmento 6 (véase la Figura suplementaria S2).
    NOTA: Descongele, mezcle y centrifugue brevemente cada componente antes de usarlo.
  2. Ejecute la PCR utilizando el protocolo de tres pasos de la Tabla 2.
  3. Agregue 1 μL de tampón de carga de ADN 6x a 5 μL de producto de PCR, mezcle y centrifugue brevemente el contenido.
  4. Analice las muestras mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%.

4. Purificación de los fragmentos de PCR

NOTA: La purificación de los productos de PCR de un gel utilizando un kit de extracción de gel (ver Tabla de Materiales) es importante para la construcción de vectores.

  1. Agregue 9 μL de tampón de carga de ADN 6x a 45 μL de productos de PCR, mezcle y centrifugue brevemente el contenido.
  2. Realizar electroforesis en gel de agarosa al 1% para separar los fragmentos de ADN.
    NOTA: No reutilice el tampón de ejecución TAE, ya que su valor de pH afectará la recuperación de fragmentos de ADN.
  3. Una vez separadas adecuadamente las bandas, utilice un bisturí afilado para extirpar cuidadosamente las bandas de ADN.
    NOTA: Minimice el tamaño de la rebanada de gel recortando el exceso de agarosa.
  4. Pesar la rodaja de gel en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL, añadir un volumen igual de tampón aglutinante a la rodaja de gel (por ejemplo, de 0,3 mL a una rodaja de 0,3 g) e incubar a 60 °C durante 7 min.
  5. Inserte una mini columna en un tubo de recolección de 2 ml. Añadir 700 μL de solución de ADN/agarosa del paso 4.4 a la minicolumna.
  6. Centrifugar a 10.000 × g durante 1 min a temperatura ambiente. Deseche el filtrado y reutilice el tubo de recolección.
  7. Añadir 300 μL de tampón aglutinante y centrifugar a 13.000 × g durante 1 min a temperatura ambiente. Deseche el filtrado y reutilice el tubo de recolección.
  8. Añadir 700 μL de tampón de lavado y centrifugar a 13.000 × g durante 1 min a temperatura ambiente. Deseche el filtrado y reutilice el tubo de recolección.
  9. Gire la minicolumna vacía durante 2 minutos a velocidad máxima para secar la matriz de la columna. Coloque la mini columna en un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mL.
  10. Añadir 20 μL de agua desionizada directamente en el centro de la membrana de la columna y dejar reposar a temperatura ambiente durante 2 min. Centrifugar a velocidad de 13.000 × g durante 1 min.
  11. Almacene el ADN a -20 °C.

5. Preparación de un vector linealizado

NOTA: Después de preparar el plásmido, se pueden utilizar las enzimas seleccionadas para cortarlo. La digestión prolongada o la digestión de doble enzima es crucial para garantizar la digestión de todo el ADN. Esto reducirá el número de clones falsos positivos en experimentos posteriores.

  1. Linealización pVAX1
    1. Prepare la mezcla de reacción a temperatura ambiente en el orden indicado (Tabla 3).
      NOTA: Se debe agregar el volumen de agua para mantener el volumen total de reacción indicado. Aquí, 1 μg del plásmido se digirió con enzimas en la mezcla de reacción. Dependiendo de la concentración del plásmido, el volumen del plásmido se puede ajustar en la mezcla de reacción.
    2. Mezclar suavemente; luego gire hacia abajo. Incubar a 37 °C en un bloque de calor o termostato de agua durante 60 min.
    3. Realizar una purificación en gel similar a la purificación de los fragmentos de PCR de la sección 4 utilizando el kit de extracción en gel (ver Tabla de Materiales).
  2. Linealización pVAX1-F1
    NOTA: pVAX1-F1 es el vector obtenido de la primera ronda de pVAX1 (NdeI y HindIII) y la recombinación del fragmento 1. pVAX1-F2 es el vector obtenido a partir de la recombinación de pVAX1-F1 (NdeI) y fragmento 2. pVAX1-F3 es el vector obtenido a partir de la ronda de recombinación de pVAX1-F2 (NdeI) y fragmento 3. pVAX1-F4 es el vector obtenido a partir de la recombinación de pVAX1-F3 (NdeI) y fragmento 4. pVAX1-F5 es el vector obtenido de la ronda de recombinación de pVAX1-F4 (EcoRV y NtoI) y el fragmento 5.
    1. Para cada vector, prepare la mezcla de reacción por separado a temperatura ambiente en el orden indicado (Tabla 3).
    2. Mezclar suavemente; luego gire hacia abajo. Incubar a 37 °C en un bloque de calor o termostato de agua durante 60 min.
    3. Realizar una purificación en gel similar a la purificación de los fragmentos de PCR de la sección 4 utilizando el kit de extracción en gel (ver Tabla de Materiales).

6. Subclonación a un nuevo vector

NOTA: Se puede lograr una buena eficiencia de clonación cuando se utilizan 50-200 ng de vector e insertos.

  1. Configure la clonación sin interrupciones de ExonArt y la reacción de ensamblaje (Tabla 4). Ajuste el volumen total de reacción a 10 μL utilizando H2O desionizado esterilizado y mezcle.
  2. Incubar la reacción en un termociclador durante 15-60 min a 50 °C. Guarde las muestras en hielo.
    NOTA: Extender la incubación hasta 60 minutos puede mejorar la eficiencia del ensamblaje.
  3. Descongele células DH5α químicamente competentes en hielo.
  4. Añadir 10 μL del producto de montaje a las células competentes; A continuación, mezcle suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo.
  5. Coloca la mezcla en hielo durante 30 min.
  6. Choque térmico a 45 °C durante 45 s y transferencia de los tubos a hielo durante 3 min.
  7. Añada 900 μL de medio SOC al tubo.
  8. Agite el tubo a 225 rpm durante 1 h en una incubadora agitadora a 37 °C.
  9. Centrifugar la reacción de transformación a 6.000 × g durante 2 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 100 μL de medio SOC fresco.
  10. Extienda la suspensión celular transformada en una placa LB separada con 50 μg/mL de kanamicina.
  11. Incubar todas las placas durante la noche a 37 °C. Escoja colonias aisladas individuales de cada placa experimental.

7. Análisis de los transformadores

  1. Elija ocho colonias en 20 μL de medio LB que contenga 50 μg/mL de kanamicina.
  2. Configure la reacción de PCR de la colonia y ejecute la PCR (Tabla 5).
    NOTA: Para la reacción de PCR de colonias para el fragmento 1, utilice los cebadores P1 y P2 (consulte el archivo complementario 1); para el fragmento 2, utilice los cebadores P3 y P4 (véase el Archivo Suplementario 1); para el fragmento 3, utilice los cebadores P5 y P6 (véase el Archivo Suplementario 1); para el fragmento 4, utilice los cebadores P7 y P8 (véase la Figura Suplementaria S2); para el fragmento 5, utilice los cebadores P9 y P10; y utilizar los cebadores P11 y P12 para detectar el fragmento 6 (véase la figura suplementaria S2).
  3. Agregue 1 μL de tampón de carga de ADN 6x a 5 μL del producto de PCR, mezcle y centrifugue brevemente el contenido.
  4. Analice los resultados utilizando electroforesis en gel de agarosa al 1%.
  5. Seleccione una colonia positiva en 5 mL de medio LB que contenga 50 μg/mL de kanamicina y crezca durante la noche a 37 °C.
  6. Obtenga el plásmido utilizando un mini kit de ADN plasmídico (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
  7. Visualice los resultados utilizando electroforesis en gel de agarosa al 1%.

Resultados

En este artículo, presentamos un sistema de recombinación in vitro para ensamblar y reparar moléculas de ADN superpuestas utilizando el cebador inverso a través de sitios de restricción introducidos continuamente (Figura 1B). Este sistema es un procedimiento simple y eficiente que comprende la preparación del vector lineal y los fragmentos de inserto que contienen voladizos introducidos por PCR con cebadores que tienen secuencias de extensión 5' y sitios de restricción aprop...

Discusión

La técnica de ensamblaje de Gibson es un método de clonación molecular basado en la recombinación in vitro para el ensamblaje de fragmentos de ADN8. Este método permite el ensamblaje de múltiples fragmentos de ADN en un plásmido circular en una reacción isotérmica de un solo tubo. Sin embargo, uno de los obstáculos para la técnica de ensamblaje de Gibson es la adquisición de fragmentos largos de ADNc. Los fragmentos largos son difíciles de amplificar con precisión por muchas...

Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el apoyo financiero de los fondos de iniciación de investigación doctoral proporcionados por la Universidad Normal Occidental de China (No. 20E059).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb plus DNA LadderTiangen Biochemical Technology (Beijing) Co., LtdMD113-02
2x Universal Green PCR Master MixRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA303-1
AgaroseSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.9012-36-6
Benchtop MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific  Co., LtdFRESCO17
Clean BenchSujing Antai Air Technology  Co., LtdVD-650-U
DNA Electrophoresis EquipmentCleaver Scientific  Co., Ltd170905117
DNA Loading Buffer (6x)Biosharp Biotechnology Co., LtdBL532A
E. Z. N. A. Gel Extraction kitOmega Bio-Tek Co., LtdD2500-01
E.Z.N.A. Plasmid DNA Mini Kit IOmega Bio-Tek Co., LtdD6943-01
Electro-heating Standing-temperature CultivatorShanghai Hengyi Scientific Instrument Co., LtdDHP-9082
ExonArt Seamless Cloning and Assembly kitRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA101-02
ExonScript RT SuperMix with dsDNaseRong Wei Gene Biotechnology Co., LtdA502-1
FastDigest Eco321 (EcoRV)Thermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0303
FastDigest HindIIIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0504
FastDigest NheIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0974
FastDigest NotIThermo Fisher Scientific  Co., LtdFD0596
Gel Doc XRBio-Rad Laboratories Co., Ltd721BR07925
Goldview Nucleic Acid Gel StainShanghai Yubo Biotechnology Co., LtdYB10201ES03
Ice Maker MachineShanghai Bilang Instrument Manufacturing Co., LtdFMB100
Invitrogen Platinum SuperFi II DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific  Co., Ltd12361010
LB Agar Plate (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B530113-0010
LB sterile liquid medium (Kanamycin)Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B540113-0001
MicropipettorsThermo Fisher Scientific  Co., Ltd—
Microwave OvenPanasonic Electric (China) Co., LtdNN-GM333W
Orbital ShakersShanghai Zhicheng Analytical Instrument Manufacturing Co., LtdZHWY-2102C
PRRSV virusSichuan Agricultural University—
SnapGeneGSL Biotech, LLCv5.1To design primers
T100 PCR Gradient Thermal CyclerBio-Rad Laboratories  Co., LtdT100 Thermal Cycler
TAE bufferSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.B040123-0010
TRIzol ReagentThermo Fisher Scientific  Co., Ltd15596026RNA extraction reagent

Referencias

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