Perfusión quirúrgica y aislamiento del páncreas porcino para el aislamiento de islotes

Resumen

Este protocolo proporciona una guía paso a paso para la adquisición de un páncreas porcino para el aislamiento y la purificación de los islotes.

Resumen

El trasplante de islotes pancreáticos es un tratamiento emergente para la diabetes tipo I; sin embargo, está limitado por la compatibilidad y disponibilidad de donantes. El xenotrasplante de islotes porcinos ofrece una alternativa prometedora al alotrasplante, con el potencial para la producción a gran escala de islotes funcionales bajo demanda. El rendimiento y la viabilidad de los islotes aislados son muy susceptibles a la calidad del páncreas donante y al método de obtención, en particular la duración del tiempo de isquemia caliente. Para mejorar la preservación de los órganos y la posterior producción y viabilidad de los islotes, hemos desarrollado un protocolo de perfusión quirúrgica y resección del páncreas porcino. Este protocolo emplea la canulación aórtica infrarrenal directa y la perfusión de órganos para minimizar el tiempo de isquemia caliente y simplificar el procedimiento para los operadores que no tienen una amplia experiencia quirúrgica. La perfusión arterial posterior del páncreas a través de la aorta elimina la sangre estancada de la microvasculatura, reduciendo así la trombosis y el daño oxidativo del tejido. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para la perfusión quirúrgica y la resección del páncreas porcino, seguida del aislamiento y la purificación de los islotes.

Introducción

La diabetes tipo 1 es causada por la destrucción autoinmune^{de las células} beta pancreáticas. En consecuencia, los pacientes son dependientes de la insulina exógena, lo que los coloca en fluctuaciones glucémicas de alto riesgo con episodios de hiperglucemia e hipoglucemia². El alotrasplante de islotes es una cura potencial para la diabetes tipo I; Sin embargo, la disponibilidad limitada de donantes de órganos pancreáticos sigue siendo una barrera importante para la adopción generalizada del procedimiento ^2,3. El xenotrasplante de ....

Protocolo

Todos los procedimientos que involucran animales están aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la División de Medicina Comparativa de la Facultad de Medicina de la Universidad de Washington. Los cerdos Yorkshire adultos de entre 35 y 35 kg son ideales para este procedimiento; Sin embargo, el protocolo se puede adaptar para cerdos de diferentes tamaños dependiendo del contexto experimental. Todo el procedimiento debe realizarse de forma estéril en un quirófano.

1. Preparación preoperatoria y anestesia

1. Sedar al cerdo con un cóctel de 4 mg/kg de ....

Discusión

El xenotrasplante de islotes pancreáticos con donantes porcinos es una estrategia prometedora para el tratamiento de la diabetes tipo I. El aislamiento de los islotes es un desafío, y la viabilidad y el rendimiento final de los islotes son altamente susceptibles a la hipotensión y la isquemia tisular encontradas durante la obtención de órganos^16,17. Para optimizar la obtención y preservación del páncreas, este protocolo p.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M NaOH, 100 mL	Millipore Sigma	1310-73-2
10x HBSS, 500 mL (15 to 30 °C)	Thermo Fisher	14065056
1x D-PBS, 500 mL	Thermo Fisher	14200075
1x HBSS, 1 L	Thermo Fisher	14025076
250 mL Conical Tubes	Millipore Sigma	CLS430236-6EA
Amphotericin B [50 mg]	Millipore Sigma	PHR1662
Antiseptic Povidone Iodine 10%	Millipore Sigma	25655-41-8
BioRad Gradient Former	BioRad	395
Calcium Chloride dihydrate	Thermo Fisher	10035-04-8
COBE Cell Processor	Ebay	317690
Digestion circuit reservoir, Gibco bottle, 1 L	Thermo Fisher	10341001
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Thermo Fisher	85190
Dithizone	Thermo Fisher	60-10-6
Gradient Former Connection Kit	BioRad	1652008
Heparin [1000 U/mL]	Emergency Medical Products	0409-2720-01
HEPES Buffer (1 M), 100 mL	Thermo Fisher	15630080
Human Serum Albumin 25%, 100 mL	Celprogen	HSA2001-25-1
Isoflurane	Covetrus	Item#:11695067772
Ketamine	Patterson	Item #:07-894-8462
Liberase (100 mg)	Millipore Sigma	5401020001
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit	Thermo Fisher	L3224
Lympholyte 1.1 Media 500 mL	Cedarlane Labs	CL5020
Masterflex LS 16 Tubing	Masterfle	96419-16
Masterflex Peristaltic Pump	Masterflex	07522-30
PenStrep (2 mg/mL)	Celprogen	PS-30-002
Pulmozyme (1 mg/mL, 2.5 mL/vial)	Dornase Alfa	8931278
Recovery Medium, PIM(R)	Prodo Laboratories, Inc.	PIM-R001GMP
RPMI 1640	Millipore Sigma	R8758-1L
Standard Culture Medium, PIM(S)	Prodo Laboratories, Inc.	PIM-S001GMP
Tzed™ (tiletamine and zolazepam) Injection C	Patterson	Item #:07-894-6240
University of Wisconsin (UW) Solution, 3 L	Global Transplant Solutions	1000-0046-06
Waterbath	Sigma Alderich	CLS6783-1EA
Xylazine	Patterson	Item #:07-891-6165