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  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este estudio examina la asociación entre la expresión del gen MLH1 en sangre periférica y el cáncer de colon, utilizando un enfoque de casos y controles para comparar los niveles de expresión en pacientes y controles sanos emparejados.

Resumen

El homólogo 1 de MutL (MLH1) es un componente del complejo heterodimérico MutLα que detecta y corrige los desajustes base-base y los bucles de inserción/deleción causados por la informatización de nucleótidos. En ausencia de la proteína MLH1, aumenta la frecuencia de desajustes no reparados, lo que resulta en cáncer de órganos. El presente estudio buscó cuantificar la expresión génica MLH1 y su relación con la invasión tumoral (T) y la invasión de ganglios linfáticos (N) en muestras de sangre de pacientes con cáncer colorrectal (CCR). Se obtuvieron muestras de sangre de 36 pacientes con CCR. Se extrajo ARN y se sintetizó ADNc utilizando un kit. Los cebadores se construyeron utilizando el enfoque de unión exón-exón, y los genes MLH1 y β-actina se probaron 3 veces utilizando la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR en tiempo real). Para analizar los datos se utilizó un software de análisis de expresión génica y una prueba t para examinar la expresión de MLH1 y su conexión con las variables T y N. En este estudio se incluyeron 36 pacientes con cáncer colorrectal, de los cuales 15 (41,6%) eran mujeres y 21 (58,4%) hombres, con una edad media de 57,35 ± 4,22 años y en el rango de edad de 26-87 años. Los resultados mostraron que la proporción de expresión génica MLH1 en los pacientes disminuyó en comparación con la de los individuos sanos, y la disminución de la expresión génica en diferentes etapas de la enfermedad fue significativa. Los resultados de este estudio mostraron que la reducción de la expresión del gen MLH1 tiene un papel eficaz en el desarrollo del CCR.

Introducción

El cáncer de colon (CCR) es uno de los tipos de cáncer más comunes. Es la cuarta causa de muerte relacionada con el cáncer en todo el mundo1. El CCR es más frecuente en hombres que en mujeres, y es de tres a cuatro veces más común en los países industrializados que en los países en desarrollo. La tasa de incidencia estandarizada por edad (global) por 1 x 105 de incidencias de CCR es de 19,7 en ambos sexos, 23,6 en hombres y 16,3 en mujeres2. Los estudios epidemiológicos han mostrado una fuerte asociación entre el ambiente y el estilo de vida y el CCR. La obesidad, la carne roja/procesada, el tabaco, el alcohol, la terapia de privación de andrógenos y la colecistectomía se asocian con un aumento moderado del riesgo de CCR 2,3.

La inestabilidad cromosómica, la inestabilidad de los microsatélites y el fenotipo metilador de la isla CpG (CIMP) desempeñan un papel importante en la tumorigénesis del CCR4. Según estudios previos, se han identificado aproximadamente 250 mutaciones diferentes en pacientes con CCR, lo que equivale a aproximadamente el 55% de las mutaciones conocidas relacionadas con los genes de reparación de errores de emparejamiento del ADN (MMR). Los defectos en las proteínas de reparación de errores de emparejamiento pueden ser causados por mutaciones de la línea germinal en los genes MSH6, MLH1, PMS2 y MSH2, y la mayoría de estas mutaciones se encuentran en los genes MLH1 y MSH2 4,5. La proteína más importante en el sistema MMR, que generalmente está involucrada en el CCR, es MLH1. Estudios recientes han demostrado que cualquier cambio en la expresión de MLH1 puede aumentar el riesgo de CCR. Las mutaciones de la línea germinal en MLH1 son responsables del síndrome de Lynch, un tipo hereditario de CCR. Además, entre el 13% y el 15% de los casos de cáncer de colon difuso están causados por una deficiencia de MLH1 basada en la hipermetilación del promotor somático 6,7,8.

El gen MLH1 se encuentra en el brazo corto del cromosoma 3 en la posición 22.2 y contiene 21 exones9. La proteína codificada por el gen MLH1 puede cooperar con una endonucleasa implicada en la reparación de errores de emparejamiento, PMS2, para generar MutLα, que forma parte del sistema MMR. MutLα está implicado principalmente en la reparación de desajustes base-base y bucles de deleción y adición como resultado de una replicación incompleta del ADN. Además, la proteína codificada está involucrada en la señalización de daño en el ADN y puede convertirse a la forma ɣMutL con la proteína MLH3, que está involucrada en la reparación de errores de emparejamiento del ADN observada en la meiosis 10,11,12. Los estudios han demostrado que MLH1 está implicado en otras actividades celulares importantes, como la regulación de los puntos de control del ciclo celular, la apoptosis, la recombinación cruzada y la incompatibilidad mitótica13.

El gen MLH1 desempeña un papel clave en el sistema de reparación de errores de emparejamiento del ADN (MMR). Un defecto en la función de este gen puede llevar a la acumulación de mutaciones genéticas y, como resultado, al desarrollo de cáncer colorrectal14. Estudios anteriores han demostrado que alrededor del 55 % de las mutaciones asociadas con los genes MMR en pacientes con CCR están relacionadas con mutaciones del gen MLH1. Además, la disminución de la expresión génica MLH1 puede conducir al síndrome de Lynch, que es una forma hereditaria de cáncer colorrectal15,16. Además, se ha observado un defecto del gen MLH1 basado en la hipermetilación del promotor somático en el 13-15% de los casos esporádicos de cáncer colorrectal17. Estas evidencias científicas demuestran que el gen MLH1 actúa como un biomarcador importante en el cáncer colorrectal, y su análisis de expresión puede proporcionar información valiosa sobre la función de la vía MMR y el riesgo genético de CCR18. La medición de los niveles de expresión de MLH1 en la sangre periférica de pacientes con cáncer de colon puede proporcionar información valiosa sobre la funcionalidad de la vía MMR, que a menudo se interrumpe en el cáncer de colon. Este método puede ser utilizado con fines pronósticos y para comprender la susceptibilidad genética al cáncer de colon19,20. Un estudio sobre la relación entre la mutación del locus G a C de MLH1 415 y el cáncer colorrectal esporádico en pacientes chinos encontró que la frecuencia del genotipo C/C de MLH1 fue significativamente mayor en pacientes con CCR esporádico que en controles, lo que sugiere una susceptibilidad genética al CCR esporádico en pacientes chinos21. Otro estudio comparó la expresión génica de los biomarcadores genéticos del CCR en muestras de sangre periférica y biopsias de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (EII), destacando el potencial del análisis de la expresión génica de la sangre periférica para comprender los biomarcadores relacionados con el cáncer de colon22.

Teniendo en cuenta el importante papel del gen MLH1 y los estudios realizados en las últimas décadas con análisis moleculares mediante el perfil de la expresión de ARNm, los cánceres se han clasificado con mayor precisión. El objetivo de este estudio fue investigar cuantitativamente la expresión de MLH1 en muestras de sangre periférica de pacientes con CCR mediante PCR en tiempo real, e investigar su relación con factores patológicos, estadios de progresión tumoral a las capas de la pared intestinal (T) y estadios de invasión a los ganglios linfáticos (N). Este estudio se llevó a cabo en 36 pacientes con CCR para establecer potencialmente cambios cuantitativos en la expresión génica como biomarcadores para la detección, el pronóstico y el diagnóstico del CCR utilizando muestras de sangre periférica.

Protocolo

Se llevó a cabo una investigación de casos y controles en el Hospital Afiliado 2 de la Universidad de Nantong entre abril de 2021 y mayo de 2023. Colaborar con el departamento administrativo del hospital para establecer el marco del estudio. La aprobación ética se obtuvo mediante la presentación de la propuesta de estudio al Comité de Ética de la Universidad de Nantong. Se siguieron las pautas éticas para garantizar la confidencialidad y el consentimiento informado.

1. Reclutamiento de pacientes y diseño del estudio

  1. Muestreo para la inclusión de los participantes en el estudio
    1. Investigar la expresión del gen MLH1 en la sangre periférica de 36 individuos con cáncer de colon y un grupo de control. Desarrollar criterios claros de inclusión y exclusión para la selección de participantes.
    2. Reclutar a personas diagnosticadas con tipos específicos de cáncer de colon (cáncer de colon rectosigmoide, ciego, ascendente, transverso y descendente que se consideraba que tenían tumores colorrectales) y tener el consentimiento informado.
    3. Excluir a las personas con otros diagnósticos de cáncer o afecciones que podrían confundir el análisis de la expresión génica. Además, excluya a los participantes con antecedentes de transfusiones de sangre en los últimos 3 meses, antecedentes de quimioterapia o radioterapia en los últimos 6 meses, antecedentes de consumo de alcohol o drogas y antecedentes de enfermedades autoinmunes o enfermedades inflamatorias intestinales.
  2. Categorizar los factores de riesgo clínico según el sistema de estadificación TNM (tumor, ganglios y metástasis), considerando la masa cancerosa, el tamaño del tumor y la invasión a los órganos adyacentes23,24.
    1. Divida los diferentes estadios del cáncer (0-4) en función de los datos disponibles del archivo de patología.
    2. Segmentar la tasa de crecimiento y progresión tumoral en las capas de la pared intestinal (índice T) en cuatro grupos distintos (T1-4, T0-TX) y la invasión de ganglios linfáticos (índice N) en cuatro grupos (N1-3, N0-NX).
  3. Prepare un grupo de control con individuos sanos.
    1. Hacer coincidir el grupo de control con el grupo de pacientes en términos de edad y sexo. Recopile datos demográficos detallados de cada participante para garantizar la comparabilidad.
  4. Proceso de consentimiento informado
    1. Preparar documentos de consentimiento informado que expliquen el propósito, los procedimientos y los riesgos potenciales del estudio.
    2. Interactúe con los participantes, dándoles tiempo suficiente para hacer preguntas. Recoja los formularios de consentimiento informado firmados antes de proceder con la recolección de muestras.

2. Extracción y purificación de ARN

  1. Recogida de muestras de sangre periférica
    1. Obtenga tubos recubiertos de EDTA disponibles en el mercado que estén certificados para uso clínico o de laboratorio. Verifica la fecha de caducidad de los tubos. Compruebe la integridad del embalaje del tubo.
    2. Indique al participante que se siente cómodamente. Con una jeringa estéril, extraiga 5 ml de sangre de la vena antecubital. Asegúrese de que el participante esté relajado, con el brazo extendido para exponer la vena. Transfiera inmediatamente las muestras de sangre a los tubos preparados, asegurando una exposición mínima al aire.
    3. Mantenga las muestras a 4 °C durante el transporte al laboratorio para preservar la integridad del ARN.
  2. Utilice un mini kit de sangre de ARN para el aislamiento de ARN siguiendo las instrucciones del fabricante.
    1. Brevemente, lise los glóbulos rojos incubando la muestra de sangre completa con Buffer EL en hielo. Centrífuga para pellet los leucocitos y desechar el sobrenadante. Lisar los leucocitos con Buffer RLT y homogeneizar el lisado utilizando una columna trituradora.
    2. Agregue etanol al lisado homogeneizado y transfiéralo a una columna de centrifugación. Lave la columna con Buffer RW1 y Buffer RPE. Eluir el ARN purificado añadiendo agua libre de ARNasa a la columna y centrifugando.
  3. Evaluación de la cantidad y calidad del ARN
    1. Cuantificación de ARN: Emplee un espectrofotómetro para medir la concentración y pureza del ARN. Abra el software en la computadora conectada. Seleccione la opción Ácido nucleico en el menú principal. Aplique 1 μL de muestra de ARN en el área de la muestra.
    2. Prueba de pureza e integridad del ARN
      NOTA: La integridad y la distribución del tamaño del ARN total purificado con el mini kit de ARN en sangre se pueden verificar mediante espectrofotómetro y electroforesis en gel. Los ARN ribosómicos deben aparecer como bandas afiladas o picos. La proporción aparente de ARNr 28S y ARNr 18S debe ser aproximadamente 2:1. Si las bandas o picos ribosómicos de una muestra específica no son nítidos, sino que aparecen como un frotis hacia ARN de menor tamaño; es probable que la muestra haya sufrido una degradación importante antes o durante la purificación del ARN.
      1. Para la medición de espectrofotometría, baje el brazo del dispositivo y haga clic en Medir para obtener la relación A260/A280. Evalúe la pureza de la muestra de ARN, con el objetivo de obtener una relación A260/A280 entre 1,8 y 2,0.
      2. Realice una electroforesis en gel de agarosa al 1% como se describe a continuación.
        1. Prepare la solución de agarosa al 1% calentando el polvo de agarosa en tampón TAE hasta que se disuelva. Añadir bromuro de etidio a la solución de agarosa para alcanzar una concentración final de 0,5 μg/mL. Vierta la solución de bromuro de agarosa y etidio en una bandeja de fundición de gel y deje que se solidifique.
          NOTA: El bromuro de etidio es un tinte fluorescente que se intercala con el ARN para permitir la visualización bajo luz ultravioleta.
        2. Mezcle las muestras de ARN con el tinte de carga y cárguelas con cuidado en los pocillos del gel solidificado. Ejecute la electroforesis en gel a 100 V durante aproximadamente 30 minutos para separar los fragmentos de ARN por tamaño. Visualice las bandas de ARN colocando el gel en un transiluminador UV o en un sistema de imágenes, lo que hace que el ARN teñido con bromuro de etidio sea fluorescente.
  4. Almacenamiento del ARN extraído
    1. Tome las muestras de ARN extraídas. Aliquotar el ARN en tubos de microcentrífuga estériles, utilizando volúmenes de 10 μL por alícuota. Almacene las alícuotas de ARN a -80 °C o menos.
  5. Transcripción inversa de ARN en ADNc
    1. Siga el protocolo del kit de transcripción inversa. Descongelar y preparar los reactivos necesarios en hielo y a temperatura ambiente.
    2. Realizar una reacción de eliminación de ADN genómico para eliminar cualquier contaminación de ADN genómico.
    3. Prepare la mezcla maestra de transcripción inversa en hielo, que contiene todos los componentes excepto el ARN plantilla.
    4. Agregue el ARN molde del paso de eliminación de ADN a la mezcla maestra de transcripción inversa. Incubar la reacción de transcripción inversa a 42 °C durante 15 min.
    5. Inactivar la enzima transcriptasa inversa incubando a 95 °C durante 3 min. Utilice una alícuota del ADNc terminado para una PCR inmediata en tiempo real o almacene el ADNc a -20 °C para su uso posterior.

3. Diseño de cebadores para PCR en tiempo real

  1. Selección de genes diana y controles internos
    1. Elegir el gen MLH1 como diana para la cuantificación debido a su asociación con el cáncer de colon. Seleccione β-actina como control interno para la normalización de los datos de expresión génica.
  2. Proceso de diseño de imprimaciones
    1. Inicie el software de diseño del cebador e introduzca la secuencia génica de MLH1 obtenida del Ensemble o del UCSC Genome Browser.
    2. Ajuste la temperatura de fusión (Tm) para los cebadores entre 58-60 °C, el contenido óptimo de GC entre 40%-60% y la longitud del cebador entre 18-24 nucleótidos.
    3. Introduzca las secuencias de cebadores diseñadas en la base de datos NCBI BLAST para confirmar la especificidad.
      1. Vaya al sitio web de BLAST, seleccione Nucleotide BLAST. Pegue las secuencias de cebadores en el cuadro de búsqueda y haga clic en BLAST.
      2. Analice los resultados para asegurarse de que no se predice ninguna amplificación fuera del objetivo. Consulte la Tabla 1 para obtener más detalles.

4. PCR en tiempo real

  1. Configuración de reacción PCR en tiempo real. Consulte la Tabla 2 para obtener más detalles.
    1. Centrifugar los reactivos a 4 °C durante 5 min a 10.000 x g para recoger el contenido en el fondo de los tubos.
    2. Prepare una mezcla maestra de acuerdo con el protocolo del kit comercial, que incluye SYBR Green, tampón, dNTPs, MgCl2 y Taq polimerasa.
    3. Asigne la mezcla maestra en tubos de PCR etiquetados, lo que garantiza la consistencia del volumen en todas las muestras.
    4. Añada el volumen adecuado de cebadores directos e inversos para MLH1 y β-actina en sus respectivos tubos.
    5. Diluya las muestras de ARN a una concentración constante de 100 ng/μL antes de la transcripción inversa y transcriba inversa a ADNc utilizando un kit de transcripción inversa.
  2. Amplificación y recopilación de datos
    1. Coloque los tubos de PCR en el sistema de PCR en tiempo real.
    2. Programe el termociclador con las condiciones de ciclo optimizadas: 95 °C durante 20 s para la desnaturalización, 54 °C durante 30 s para el recocido y 72 °C durante 30 s para la extensión. Consulte la Tabla 3 para obtener más detalles.
    3. Configure la máquina para que funcione durante 45 ciclos.
    4. Monitoriza la reacción en tiempo real en la interfaz del software del sistema, observando las curvas de amplificación de cada muestra.
    5. Incluya un control negativo sin ADNc para comprobar si hay contaminación. Repita la ejecución de PCR 3 veces para cada muestra para garantizar la fiabilidad de los datos.
  3. Análisis de datos
    1. Después de completar los ciclos, utilice el software del sistema para analizar los valores del ciclo umbral (Ct). Exporte los valores Ct a un programa de hoja de cálculo para su posterior análisis.
    2. Calcular la expresión génica relativa utilizando el método 2-ΔΔCt 25, normalizando los datos al control de β-actina.

5. Inmunohistoquímica y análisis genéticos

  1. Realizar inmunohistoquímica en secciones de tejido para correlacionar la expresión de la proteína MLH1 con los niveles de expresión génica.
    1. Prepare portaobjetos de tejido y aplique el anticuerpo anti-MLH1.
    2. Utilice un kit de sustrato de anticuerpo secundario conjugado con HRP y DAB (3,3'-diaminobencidina). Revele los portaobjetos de acuerdo con las instrucciones del kit y analícelos con un microscopio óptico.
  2. Realizar pruebas de PCR específica de metilación e inestabilidad de microsatélites para diferenciar entre el síndrome de Lynch y el CCR esporádico.
    1. Usa un kit comercial de extracción de ADN. Siga el protocolo del kit tanto para la sangre como para los tejidos tumorales.
    2. Trate el ADN con un kit de conversión de bisulfito. Utilice cebadores específicos de metilación diseñados para la región promotora de MLH1. Realice PCR según el protocolo del kit.
    3. Ejecute electroforesis en gel en los productos de PCR para visualizar el estado de metilación.
    4. Para las pruebas de inestabilidad de microsatélites (MSI), electroforesis capilar mediante un analizador genético. Compare las longitudes de los microsatélites mediante el análisis de productos de PCR marcados con fluorescencia.

6. Análisis estadístico

  1. Emplear software de análisis estadístico comercial para el análisis de datos.
    1. Abra el software y cree un nuevo conjunto de datos para la expresión génica y los datos demográficos.
    2. Introduzca los valores relativos de expresión génica y los datos demográficos correspondientes en el conjunto de datos.
    3. Utilice la prueba de Kolmogorov-Smirnov para evaluar la normalidad de los datos.
      1. Seleccione Analizar en el menú superior, elija Pruebas no paramétricas y, a continuación, Cuadros de diálogo heredados.
      2. Haga clic en la prueba de Kolmogorov-Smirnov e ingrese la variable para la expresión génica. Ejecute la prueba e interprete la salida para la significación de la normalidad de la distribución.
    4. Realizar pruebas T para comparar la expresión del gen MLH1 entre los grupos de pacientes y control.
      1. Seleccione Analizar, luego Comparar medias y elija Prueba T de muestras independientes.
      2. Asigne la pertenencia al grupo (paciente o control) como variable de agrupación y la expresión génica como variable de prueba. Ejecute la prueba e interprete el nivel de significación de dos colas.
    5. Calcular los cambios de pliegue en la expresión génica utilizando el método 2-ΔΔCt 25.

Resultados

En este estudio, se examinó a 36 pacientes con cáncer de colon para determinar la expresión del gen MLH1 en la sangre periférica y su relación con el cáncer de colon. El análisis de las variables demográficas mostró que 15 pacientes (41,6%) eran mujeres y 21 pacientes (58,4%) eran hombres. La edad media de los pacientes fue de 57,35 ± 4,22 años, y el rango de edad fue de 26-87 años. El estado del índice de masa corporal (IMC) de los pacientes mostró que 14 paciente...

Discusión

Este estudio se llevó a cabo con el objetivo de investigar la expresión del gen MLH1 . En este estudio, se demostró que el nivel de expresión del gen MLH1 disminuyó en las personas enfermas en comparación con las personas sanas. Con base en estudios de cambio de pliegue, se ha demostrado que la expresión del gen MLH1 en las etapas II, III y IV en personas enfermas en comparación con las personas sanas tuvo una disminución significativa.

Divulgaciones

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Nos gustaría expresar nuestra gratitud y aprecio a todos los que nos ayudaron a completar este esfuerzo de investigación.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose Gel Electrophoresis EquipmentBio-RadMini-Sub Cell GT SystemsUsed to check RNA quality
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma-AldrichE9884Used as an anticoagulant for blood samples
NanoDropThermoFisher ScientificND-2000Spectrophotometer used to determine RNA purity
Real-time PCR MachineApplied BiosystemsA34322Used for RT-PCR reactions
RNA Extraction KitIntron Biotechnology Co#Cat 17061Used for RNA extraction from blood samples
SYBR Green PCR KitThermo Fisher Scientific4309155Reagents used for RT-PCR experiments

Referencias

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