Lesión crónica por constricción del nervio infraorbitario distal (DIoN-CCI) en ratones para estudiar el dolor neuropático del trigémino

Resumen

La lesión crónica por constricción del nervio infraorbitario distal en ratones induce cambios en el comportamiento espontáneo (aumento de la actividad de acicalamiento facial) y el comportamiento nocifensivo en respuesta a la estimulación táctil (hiperreactividad a la estimulación del cabello de von Frey) que son signos de dolor continuo y alodinia, y sirven como modelo para el dolor neuropático del trigémino.

Resumen

Los modelos animales siguen siendo herramientas necesarias para estudiar el dolor neuropático. Este manuscrito describe el modelo de lesión crónica por constricción del nervio infraorbitario distal (DIoN-CCI) para estudiar el dolor neuropático del trigémino en ratones. Esto incluye los procedimientos quirúrgicos para realizar la lesión por constricción crónica y las pruebas conductuales postoperatorias para evaluar los cambios en el comportamiento espontáneo y evocado que son signos de dolor continuo y alodinia mecánica. Los métodos y las lecturas de comportamiento son similares al modelo de lesión crónica por constricción del nervio infraorbitario (IoN-CCI) en ratas. Sin embargo, son necesarios cambios importantes para la adaptación del modelo IoN-CCI a ratones. En primer lugar, el abordaje intraorbital se sustituye por un abordaje más rostral con una incisión entre el ojo y la almohadilla de los bigotes. Por lo tanto, el IoN se liga distalmente fuera de la cavidad orbitaria. En segundo lugar, debido a la mayor actividad locomotora en ratones, permitir que las ratas se muevan libremente en jaulas pequeñas se reemplaza colocando a los ratones en dispositivos de restricción diseñados y construidos a medida. Después de la ligadura de DIoN, los ratones muestran cambios en el comportamiento espontáneo y en respuesta a la estimulación del cabello de von Frey que son similares a los de las ratas IoN-CCI, es decir, un aumento del aseo facial dirigido e hiperreactividad a la estimulación del cabello de von Frey del territorio de IoN.

Introducción

El dolor neuropático surge de un daño en el sistema nervioso somatosensorial, que conduce a una transmisión anormal de señales sensoriales al cerebro. El daño del nervio somatosensorial no siempre conduce al dolor neuropático, pero la prevalencia aumenta con la gravedad de la neuropatía clínica ^1,2. Los pacientes con dolor neuropático experimentan síntomas específicos como sensaciones espontáneas (ardor, hormigueo, sensaciones eléctricas) y dolor anormalmente intenso o prolongado a estimulación inocua o nociva que tienden a volverse crónicos y resistentes al tratamiento con analgésicos convencionales³. El progreso significativo en el campo de la investigación del dolor neuropático se deriva del descubrimiento de que las ligaduras débiles que se contraen alrededor del nervio ciático en ratas conduce a comportamientos que se asemejan a las condiciones de dolor neuropático humano^. Los animales muestran umbrales reducidos al calor, al frío y a la estimulación mecánica, y exhiben comportamientos nocifensivos. A pesar de las diferencias biológicas inherentes en el procesamiento del dolor entre humanos y roedores, los modelos animales son una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos subyacentes en el desarrollo del dolor neuropático y probar las estrategias de tratamiento recientemente propuestas.

Los paradigmas de las pruebas de dolor basadas en reflejos sensoriales se han utilizado ampliamente en modelos de dolor neuropático, pero la medición del dolor continuo u otras alteraciones frecuentemente acompañadas (trastorno del sueño, depresión, ansiedad) no ha recibido suficiente atención considerando que estos son síntomas clínicos comunes que afectan la calidad de vida 5,6,7,8 . El comportamiento de acicalamiento facial en ratas ha sido documentado como una medida del dolor neuropático espontáneo después de una lesión crónica por constricción (ICC) del nervio infraorbitario (IoN)^9,10. Además, las ratas también desarrollan hiperreactividad a la estimulación táctil leve del territorio IoN, lo que es indicativo de alodinia mecánica.

En comparación con los ratones, debido a su mayor tamaño, las ratas son más adecuadas para las lesiones quirúrgicas. Sin embargo, los ratones ofrecen eficiencia en costos y espacio y requieren cantidades más pequeñas de fármacos. Además, el advenimiento de la tecnología transgénica ha impulsado aún más el uso de ratones^11,12. Por lo tanto, el objetivo general de este procedimiento es realizar una lesión quirúrgica del nervio infraorbitario en ratones, similar a la de ratas, que induce cambios en el comportamiento espontáneo y evocado para el estudio del dolor neuropático del trigémino.

Protocolo

Los animales son tratados y cuidados de acuerdo con las directrices para la investigación del dolor en animales conscientes de la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor y de acuerdo con la normativa flamenca y europea para la investigación con animales y las directrices ARRIVE. El protocolo es aprobado por el Comité de Ética institucional.

1. Animales

1. Utilice ratones machos y hembras C57BL/6J (Janvier, 10 semanas de edad a su llegada).
2. Aloje a los ratones macho y hembra por separado en jaulas estándar de fondo sólido en una sala de colonias con una humedad del 40% al 60% y una temperatura ambiente (RT) de 21 ± 1 °C.
3. Proporcionar agua y alimentos ad libitum.
4. Mantenga a los ratones bajo un ciclo normal de luz/oscuridad de 12:12 h (las luces se encienden a las 08:00).

2. Cirugía

1. Por ratón, prepare una pieza de ligadura de intestino crómico (6-0) de aproximadamente 6 cm de largo y colóquela en solución salina estéril para evitar que se seque y se vuelva rígida y quebradiza.
2. Anestesiar al ratón con ketamina/xilacina (75/15 mg/kg, intraperitoneal, volumen de inyección 10 mL/kg). Verifique la profundidad de la anestesia pellizcando la piel entre los dedos de los pies. Asegúrese de que el mouse no flexione la pierna. Si es necesario, espere hasta que el animal esté completamente anestesiado y/o administre ketamina/xilacina adicional.
   NOTA: No se deben administrar analgésicos suplementarios para evitar efectos analgésicos preventivos que puedan interferir con el desarrollo del dolor neuropático del trigémino.
3. Afeitar suavemente el vello bucal entre la almohadilla del bigote y el ojo para hacer una incisión de aproximadamente 4 mm justo rostral al agujero infraorbitario. Tenga cuidado de no dañar los bigotes, ya que esto puede afectar las pruebas de comportamiento.
4. Fije la cabeza del ratón en un marco estereotáxico o fije la cabeza de otra manera. Coloque el mouse sobre una almohadilla térmica o tenga cuidado de mantener la temperatura corporal de lo contrario.
5. Aplique ungüento en ambos ojos para evitar que se sequen. Frote el área de la cabeza afeitada con alcohol y luego con betadine. Coloque un paño quirúrgico que exponga el área de la cabeza afeitada.
6. Utilice un microscopio para los pasos 2.7 a 2.14.
7. Haga una incisión en la piel de 4 mm perpendicular a la línea media, aproximadamente a mitad de camino entre el borde de la almohadilla del bigote y el ojo, justo rostral al agujero infraorbitario, y centrada alrededor de la línea entre el centro del ojo y el centro de la almohadilla del bigote.
8. Exponga la IoN separando sin rodeos el tejido conectivo superficial. Tenga cuidado de minimizar el daño muscular y evite las fibras nerviosas motoras. Asegúrese de que el tronco del IoN (1-1,5 mm de diámetro) sea accesible aproximadamente 3 mm de profundidad entre donde sale del cráneo y donde se ramifica hacia la almohadilla de los bigotes (Figura 1).
9. Con un movimiento giratorio, deslice la cabeza de una ayuda de ligadura en forma de gancho debajo de la IoN, teniendo cuidado de no dañar el nervio.
10. Coloque la ligadura de intestino crómico a través del orificio en la punta de la ayuda de ligadura y retraiga la ayuda de ligadura para que la ligadura permanezca debajo de la IoN y ambos extremos de la ligadura estén más o menos equidistantes de la IoN.
11. Ata un "nudo corredizo" desde los dos extremos de la ligadura y desliza el nudo contra el IoN. Asegúrese de que el nudo corredizo permita una acción suave para que el grado de constricción se pueda controlar con precisión. Deslice el nudo más y constriña el IoN. Reducir el diámetro del nervio en una cantidad notable⁴. Coloque un nudo normal encima del nudo cortado para evitar que se deslice.
12. Corta los extremos de la ligadura dejando aproximadamente 1,5 mm de extremos libres para evitar que el nudo se deshaga.
13. Realice la cirugía simulada siguiendo los pasos 2.2-2.8.
14. Cierre la incisión cutánea con suturas sintéticas absorbibles (6-0) y permita que el animal se recupere sobre una almohadilla térmica o bajo una lámpara calefactora infrarroja.

3. Pruebas de comportamiento

1. Aclimatar el ratón a las condiciones de la carcasa durante al menos 8 días antes de las pruebas preoperatorias.
2. Antes de la prueba preoperatoria, habitúrelo al procedimiento de prueba al menos una vez al día durante 3 días.
3. Realice pruebas en condiciones normales de iluminación. Si es necesario, proporcione ruido de fondo para minimizar las molestias de los ruidos exteriores.
4. Observación del comportamiento de aseo facial
   1. Lleve un solo ratón desde la carcasa hasta la sala de pruebas en una jaula de plástico cubierta sin ningún material de cama. Evite la estimulación externa durante el transporte de los animales.
   2. Coloque el ratón en una jaula de plástico transparente cubierta sin ropa de cama (largo x ancho x alto: 12 cm x 12 cm x 17 cm) frente a una cámara de video. Coloque un espejo para ver la cara del animal cuando esté de espaldas a la cámara.
   3. Registre el comportamiento del ratón durante 10 minutos. Durante la grabación, asegúrese de que el experimentador no esté presente en la habitación.
   4. Después de grabar al siguiente animal, limpie la jaula de observación.
   5. Pida a un observador que esté ciego a las condiciones experimentales del ratón que analice el comportamiento registrado.
   6. Observe cada episodio de aseo facial mientras analiza la grabación de 10 minutos. El aseo facial son patrones de movimiento en los que el animal pone sus patas delanteras en contacto con las áreas faciales.
   7. Haga una distinción entre el acicalamiento facial aislado y los comportamientos de acicalamiento facial durante el aseo corporal⁹. Si una secuencia no está precedida o seguida por el aseo corporal, el episodio se etiqueta como acicalamiento facial aislado. El aseo corporal se define como patrones de movimiento que ponen las patas, la lengua o los incisivos en contacto con un área del cuerpo que no sea la cara o las patas delanteras. Si el acicalamiento corporal está presente antes o después de una secuencia de acicalamiento facial, el episodio se etiqueta como acicalamiento facial durante el aseo corporal.
   8. Determine el número de episodios de acicalamiento facial aplicando un criterio de corte de 4 s. Un período de tiempo entre acciones de acicalamiento de menos de 4 s se define como una pausa dentro de un solo episodio. Un período de tiempo superior a 4 s se define como una interrupción completa de las acciones de acicalamiento entre dos episodios.
5. Pruebas de estimulación mecánica
   1. Lleve ratones en grupos de hasta 6 animales desde el alojamiento hasta la sala de pruebas en una jaula cubierta con ropa de cama. De nuevo, ten cuidado de evitar la estimulación externa.
   2. Coloque los ratones uno a la vez sobre una mesa.
      1. Coloque la cola del mouse en una abrazadera de silicona suave y fije la abrazadera magnéticamente a una placa de metal sobre la mesa. El material de silicona evita que la cola se deslice de la abrazadera y minimiza la presión sobre la cola.
      2. Coloque un soporte de plástico de tres paredes (65 mm x 25 mm x 23 mm) sobre el animal de modo que solo sobresalga la cabeza del ratón del recipiente. El tamaño del soporte permite los movimientos de la cabeza y las patas delanteras, pero evita que el animal se dé la vuelta dentro de él. Finalmente, coloque un peso encima del soporte para mantenerlo en su lugar (Figura 2).
   3. Utilice una serie graduada de cuatro pelos de von Frey. La fuerza necesaria para doblar los pelos es de 0,02 g, 0,16 g, 0,4 g y 1,0 g.
   4. Habitúe a los ratones a la restricción y a los movimientos de alcance durante 10 min. Cada 30 s, haga un movimiento de alcance por animal.
   5. Cuando el animal esté en un estado relajado, aplique lentamente el pelo de von Frey más claro dentro del territorio IoN cerca del centro de las vibrisas hasta que el pelo de von Frey se doble. Asegúrese de que la estimulación no dure más de 1 s.
   6. Puntúe la respuesta del animal a la estimulación para que encaje en una de las siguientes categorías de respuesta.
      1. Dé una puntuación de 0 cuando no haya respuesta.
      2. Dé una puntuación de 1 para la detección, es decir, el ratón gira la cabeza hacia el objeto estimulante y luego explora el objeto estímulo.
      3. Dé una puntuación de 2 para la reacción de retirada, es decir, el ratón gira la cabeza suavemente hacia afuera o la tira rápidamente hacia atrás cuando se aplica la estimulación; A veces, se produce una toallita facial única ipsilateral a la zona estimulada.
      4. Da una puntuación de 3 por atacar, es decir, el ratón ataca el objeto estímulo, haciendo movimientos de morder y/o agarrar.
      5. Dé una puntuación de 4 para el aseo facial asimétrico, es decir, el ratón exhibe una serie ininterrumpida de al menos tres movimientos de lavado de cara dirigidos hacia el área facial estimulada.
   7. Para cada ratón, aplique pelos de von Frey en orden ascendente de intensidad y estimule aleatoriamente los lados ipsilateral y contralateral. Aplica cada intensidad de estímulo una vez en cada lado.
   8. Calcule la puntuación media a partir de las respuestas a los cuatro pelos de von Frey dentro de cada animal. Calcule puntuaciones separadas para los lados ipsilateral y contralateral.

Resultados

Los ratones DIoN-CCI muestran un fuerte aumento postoperatorio en el tiempo dedicado al acicalamiento facial aislado y en el número de episodios de acicalamiento facial aislado (Figura 3). El aumento más fuerte ocurre durante la primera semana postoperatoria y luego se vuelve más pequeño durante las semanas siguientes, pero se incrementa significativamente durante al menos 6 semanas. El aseo facial durante el aseo corporal no se ve más o menos afectado....

Discusión

En ratas, se ha argumentado previamente que es preferible un enfoque intraorbital de la IoN, considerando la importancia de la musculatura fina intacta que controla los patrones complejos de batido en la discriminación vibrissotáctil y la distancia relativa de la incisión de la línea media al territorio nervioso infraorbitario cutáneo¹⁰. Otros han argumentado que un abordaje distal a través de una incisión en la piel pilosa caudal a la almohadilla vibrisal ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromic catgut (6-0)	Dynek	CG602D	ligatures
Cotton applicator	Pharmacy
Digital video camera	Sony	HDR-CX330E
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont forceps - Micro-blunted tips (#5/45)	Fine Science Tools	11253-25
Duratears	Alcon	0037-820	ophthalmic ointment
Hooked ligation aid	Fine Science Tools	18062-12
Ketalar	Pfizer		ketamine (50 mg/mL)
Operation microscope	Kaps	SOM 62
Precision cotton swab	Qosina	10225
Precision trimmer	Philips	HP6392/00
Rompun	Bayer		xylazine (2%)
Scissors - blunt tips	Fine Science Tools	14574-09
Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer kit	Stoelting	58011
Vicryl Rapide	Ethicon	MPVR489H	sutures