Un modelo murino de insuficiencia cardíaca inducida por hiperlipidemia con fracción de eyección preservada

Resumen

Este protocolo presenta un enfoque detallado para replicar un modelo murino de insuficiencia cardíaca inducida por hiperlipidemia con fracción de eyección preservada (HFpEF). El diseño combina la administración de virus adenoasociado al virus 9-troponina T de baja densidad con receptor de lipoproteínas de baja densidad (AAV9-cTnT-LDLR) y poloxámero-407 (P-407).

Resumen

La fisiopatología de la insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (HFpEF) impulsada por lipotoxicidad no se conoce completamente. Dada la urgente necesidad de modelos animales que imitaran con precisión la HFpEF cardiometabólica, se desarrolló un modelo murino inducido por hiperlipidemia mediante ingeniería inversa de los fenotipos observados en pacientes con HFpEF. Este modelo tenía como objetivo investigar la ICFEP, centrándose en la interacción entre la lipotoxicidad y el síndrome metabólico. La hiperlipidemia se indujo en ratones de tipo salvaje (WT) con una cepa de fondo de 129J mediante inyecciones intraperitoneales quincenales de poloxamer-407 (P-407), un copolímero en bloque que bloquea la lipoproteína lipasa, combinada con una única inyección intravenosa del virus adenoasociado 9-troponina cardíaca T-receptor de lipoproteínas de baja densidad (AAV9-cTnT-LDLR). Se realizaron evaluaciones exhaustivas entre 4 y 8 semanas después del tratamiento, que incluyeron ecocardiografía, registro de la presión arterial, pletismografía de cuerpo entero, telemetría de ecocardiografía (ECG), monitorización de la rueda de actividad (AWM) y análisis bioquímicos e histológicos. Los ratones LDLR/P-407 mostraron características distintivas a las cuatro semanas, incluyendo disfunción diastólica, fracción de eyección preservada y aumento del grosor de la pared del ventrículo izquierdo. En particular, la presión arterial y la función renal se mantuvieron dentro de los rangos normales. Además, el ECG y la AWM revelaron bloqueos cardíacos y reducción de la actividad, respectivamente. La función diastólica se deterioró a las ocho semanas, acompañada de una disminución significativa de la frecuencia respiratoria. Investigaciones posteriores sobre el modelo de doble tratamiento revelaron fibrosis elevada, proporciones de pulmones húmedos/secos y relaciones de peso cardíaco/peso corporal. Los ratones LDLR/P-407 presentaron xantelasmas, ascitis e isquemia cardíaca. Curiosamente, las muertes súbitas ocurrieron entre 6 y 12 semanas después del tratamiento. El modelo murino de HFpEF ofrece un recurso experimental valioso y prometedor para dilucidar las complejidades del síndrome metabólico que contribuye a la disfunción diastólica en el contexto de la HFpEF mediada por lipotoxicidad.

Introducción

La insuficiencia cardíaca con fracción de eyección preservada (ICFEP) denota un síndrome cardiometabólico acompañado de múltiples comorbilidades y constituye más del 50% de todos los casos de insuficiencia cardíaca ^1,2. Además, la frecuencia de HFpEF ha aumentado constantemente durante la última década³. Con opciones de tratamiento limitadas, la ICFEP representa la necesidad médica no cubierta más importante en la enfermedad cardiovascular, dada su fisiopatología multifacética⁴. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de mejorar la comprensión de los mecanismos subyacentes y la fisiopatología de la ICFEP para desarrollar terapias efectivas.

A pesar de los avances significativos en los últimos años, la fisiopatología de la ICFEP atribuida a la lipotoxicidad sigue sin comprenderse completamente. Se establece que los pacientes con ICFEP presentan una notable acumulación de lípidos miocárdicos en comparación con aquellos con insuficiencia cardíaca con fracción de eyección reducida (ICFEr) y controles sanos⁵. Los datos de secuenciación de ARN de biopsias cardíacas mostraron una regulación a la baja del gen de la lipoproteína lipasa (LPL) en el grupo de HFpEF en comparación con los pacientes sanos y con HFrEF⁶. El poloxámero-407 (P-407) es un copolímero en bloque que induce hiperlipidemia al bloquear LPL y posteriormente aumentar los triglicéridos plasmáticos y el colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL)⁷. Estudios previos demostraron una alta expresión del receptor de LDL (LDLR) en el corazón de ratones HFpEF⁸.

Sobre la base de estos hallazgos y reconociendo la necesidad apremiante de modelos animales que imitaran con precisión la HFpEF cardiometabólica, se desarrolló y presentó un modelo murino inducido por hiperlipidemia. Este modelo se adaptó para explorar la ICFEP, centrándose explícitamente en la implicación de la lipotoxicidad junto con el síndrome metabólico. Inducido por hiperlipidemia/bloqueo de LPL y aumento de la expresión cardíaca de LDLR, este modelo se estableció en ratones WT-129 con fondo de 129J mediante inyecciones intraperitoneales (i.p.) quincenales de P-407 combinadas con una única inyección intravenosa (i.v.) de virus adenoasociado 9-troponina cardíaca T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)⁹.

Entre las 4 y las 8 semanas después del tratamiento, se realizó una amplia gama de evaluaciones, que abarcaron ecocardiografía, registros de presión arterial, pletismografía de cuerpo entero (WBP), telemetría de electrocardiografía continua (ECG), monitorización de la rueda de actividad (AWM), así como análisis bioquímicos e histológicos⁹. A las cuatro semanas, los ratones LDLR/P407 o de "doble tratamiento" mostraron características distintivas de HFpEF, incluyendo disfunción diastólica, fracción de eyección preservada y aumento del grosor de la pared ventricular izquierda⁹. Además, la telemetría del ECG y la AWM revelaron bloqueos cardíacos y reducción de la actividad, respectivamente. Cabe destacar que la presión arterial y la función renal se mantuvieron normales⁹. A las ocho semanas, la función diastólica se deterioró y las mediciones de la WBP revelaron una reducción de la frecuencia respiratoria⁹.

La exploración adicional del modelo de doble tratamiento reveló fibrosis, proporciones elevadas de pulmón húmedo/seco y relaciones peso cardíaco/peso corporal⁹. La necropsia reveló ascitis, isquemia cardíaca y xantelasmas. Curiosamente, se documentaron muertes súbitas entre 6 y 12 semanas después del tratamiento⁹. Este modelo murino de HFpEF impulsado por hiperlipidemia proporciona una herramienta experimental rápida, valiosa y prometedora para desentrañar las complejidades del síndrome metabólico que contribuye a la disfunción diastólica con HFpEF mediada por lipotoxicidad.

Protocolo

El protocolo animal fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Miami, de conformidad con las directrices del Instituto Nacional de Salud (NIH) (protocolo IACUC 23-103-ad03). Para el presente estudio, se adquirieron ratones de tipo salvaje (WT) con fondo 129J de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales) y se criaron internamente. Todos los ratones eran compañeros de camada en el fondo 129J. Los experimentos incluyeron ratones machos y hembras. El ratón LDLR/P-407 HFpEF se estableció administrando una dosis única de AAV9-cTnT-LDLR en la primera semana y p407 quincenal durante cuatro semanas.

1. Preparación y administración de AAV9-cTnT-LDLR

NOTA: El plásmido AAV9-cTNT-hLDLR (ver Tabla de Materiales) codifica la proteína LDLR humana completa (2664bp) (Figura 1).

1. Preparación de vectores virales AAV-LDLR
   1. En función del número de animales, descongele los viales de AAV9 en hielo durante 20 minutos, luego diluya las partículas de AAV en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco para obtener una concentración de 1 x 10¹² genomas vectoriales/ratón en 100 μL.
   2. Coloque la solución viral en una aguja de 28-30 g en una jeringa de 1 ml. Tenga cuidado de evitar que entren burbujas de aire en la aguja.
2. Procedimientos de inyección intravenosa (i.v.) en la vena de cola
   1. Encienda el oxígeno hasta 0,5 L/min y ajuste el sistema de anestesia de isoflurano al 4%-5%. Coloque el ratón en la cámara de inducción durante ~ 2 minutos, hasta que el animal no responda.
   2. Coloque al animal en un retenedor iluminador de cola de ratón (por ejemplo, Braintree Scientific, Inc. (Braintree, MA)) y acomode al animal acostado de lado. Use anestesia con isoflurano al 2%-3% para el mantenimiento.
      NOTA: El calentamiento por el dispositivo de restricción causará la dilatación de la vena de la cola de los ratones y, por lo tanto, facilitará significativamente la inyección.
   3. Identifica la vena lateral de la cola. Limpie el área de inyección con un antiséptico usando una gasa.
   4. Sostén el extremo de la cola para extenderla, y masajea la cola del ratón con los dedos hasta visualizar la vena. Inserte la aguja en un ángulo bajo (ángulo de 10-15 grados) e inyecte 100 μL de AAV diluido en la vena de la cola (Figura 2A).
   5. Retire la aguja y aplique presión inmediatamente con un dedo hasta que se detenga el sangrado. Devuelve el ratón a la jaula original.

2. Preparación y administración del P-407

1. Preparación del P-407
   1. Prepare la solución diluyendo el agente P-407 (consulte la Tabla de materiales) con DPBS hasta una concentración final de 100 mg/mL dentro de una campana extractora. Refrigere la solución a 4 °C durante la noche en un rotador para facilitar la disolución del P-407¹⁰.
2. Procedimiento quincenal de inyección intraperitoneal (i.p.)
   1. Pesar cada ratón el primer día de las inyecciones de i.p. Utilizando la fórmula 1 g/kg, calcule la dosis adecuada para cada ratón en función de los pesos y las jeringas de precarga.
   2. Debajo de una campana extractora, sujete manualmente el ratón con la cabeza y el cuerpo inclinados hacia abajo para reposicionar los órganos internos cranealmente. Esta técnica evita la punción de estructuras vitales en las proximidades.
   3. Identificar la cavidad peritoneal izquierda en el cuadrante inferior del abdomen, lateral a la línea media. Limpie el sitio con un antiséptico.
   4. En un ángulo de 45 grados o menos, inserte la aguja en la cavidad peritoneal (Figura 2B). Aspire la jeringa para asegurar una inserción adecuada.
   5. Si hay sangre o tejido en la aspiración, retire la aguja y repita los pasos 2.2.2 -2.2.4 hasta que la jeringa esté limpia. Deseche la aguja en el recipiente apropiado para objetos punzantes y devuelva el ratón a la jaula original.

3. Valoración ecocardiográfica

1. Preparación
   1. Aplique la crema depilatoria en el pecho y la parte superior del abdomen del ratón el día anterior o varias horas antes de la toma de imágenes. Retire la crema con una gasa húmeda después de 2 minutos.
   2. Anestesiar al ratón con isoflurano al 2,5%-3,0% a un caudal de 0,8 L/min y mantener con isoflurano al 1%-1,5%. A continuación, fije el ratón a la plataforma adecuada en posición supina con las patas sobre almohadillas de electrodos con gel conductor y cubra la nariz y la boca con un cono nasal para garantizar la anestesia continua con isoflurano.
2. Vista paraesternal de eje largo
   1. Con el ratón colocado en posición supina, incline el lado derecho de la plataforma 45 grados.
   2. A continuación, alinee diagonalmente la sonda del transductor en el sistema de rieles, inclinándola 30-40 grados en el sentido de las agujas del reloj desde la extremidad superior derecha hasta el abdomen izquierdo para obtener y almacenar imágenes en modo B.
   3. Analice las imágenes en modo B utilizando un software de análisis de ultrasonido (consulte la tabla de materiales) para obtener la fracción de eyección (Figura 3A).
3. Vista paraesternal de eje corto
   1. Gire la sonda del transductor en el sistema de rieles 90 grados en el sentido de las agujas del reloj para obtener y almacenar imágenes en modo B y modo M.
4. Vista apical
   1. Incline la esquina superior izquierda de la plataforma hacia abajo y hacia la derecha. Oriente el transductor hacia el hombro derecho del animal.
   2. Visualiza la válvula mitral en modo B y modo Doppler color. Adquirir y almacenar imágenes Doppler de ondas pulsadas (PW) y Doppler tisular⁵.
   3. Analice las imágenes de PW Doppler y Doppler tisular utilizando el software de análisis de ultrasonido para obtener el IVRT, E/E' y E/A (Figura 3B-E).

4. Registro de datos de bucle de presión-volumen (PV)

1. Realizar análisis hemodinámicos al final del estudio para evaluar la función sistólica y diastólica del ventrículo izquierdo (VI), siguiendo el procedimiento descrito anteriormente^11,12.
   1. Comience por inducir al ratón con isoflurano (3-5%, cámara de inducción).
   2. Cuando se inicie la acción anestésica, transfiera al animal al banco quirúrgico y mantenga la anestesia con isoflurano (1-3%, mascarilla).
   3. Hacer una pequeña incisión en la piel sobre el cuello para permitir la intubación endotraqueal (a través de la boca).
   4. Ventile al animal con una mezcla de oxígeno e isoflurano utilizando un ventilador para roedores (por ejemplo, Micro vent modelo 848, Harvard Apparatus) ajustado a un volumen de ~0,15-0,2 mL y la frecuencia respiratoria a 120-170 respiraciones/min.
   5. Controle la temperatura corporal a ~37 °C ± 1 °C durante todo el procedimiento utilizando una mesa quirúrgica con temperatura controlada.
   6. Exponer y canular la vena yugular interna izquierda con una aguja de 30 G para la administración de líquidos.
   7. Corta la piel sobre el sitio del cuello ventral mediano y expone la arteria carótida. Después de la oclusión de la porción distal de la arteria carótida derecha, se debe hacer una pequeña incisión en la arteria para permitir la introducción de un catéter de presión-volumen (PV) con micropunta (ver Tabla de materiales) en el ventrículo izquierdo (abordaje torácico cerrado).
   8. Registre los bucles PV durante el estado estacionario y la oclusión de la vena cava inferior.
   9. Al final del experimento, eutanasia humanitaria del animal (bajo anestesia profunda) utilizando un método AVMA aprobado (por ejemplo, isoflurano seguido de dislocación cervical).
   10. Analice los datos fotovoltaicos utilizando el software LabChart (consulte la Tabla de Materiales) y calibre los volúmenes utilizando mediciones ecocardiográficas.

Discusión

A pesar del aumento constante de la prevalencia de HFpEF en la última década, sigue siendo difícil comprender de forma concreta la fisiopatología subyacente¹³. Además, a día de hoy, la terapia basada en la evidencia es limitada¹³. Es necesario una mejor comprensión de los mecanismos implicados en la HFpEF cardiometabólica. Anteriormente, se introdujo un modelo de ratón hiperlipidémico que imita la ICFEP sin enfermedad renal crónica (ERC) ni hipertensión inducida por inyecciones de LDLR IO cardíaco y p407⁹.

Los hallazgos revelaron que la combinación de LDLR OP cardíaco e hiperlipidemia resulta en disfunción diastólica, arritmias, hipertrofia ventricular izquierda (VI), intolerancia al ejercicio, acumulación de lípidos cardíacos y fibrosis en ratones después de cuatro semanas, como se publicó previamente⁹. También se observó un aumento en la absorción de colesterol LDL en el corazón, el hígado y los músculos esqueléticos y una disminución de los triglicéridos en el corazón y el hígado de estos ratones⁹. La ventaja de este método radica en su rapidez para investigar las vías del síndrome cardiometabólico, que no se conocen bien en comparación con otros modelos de ratón hiperlipidémicos de HFpEF, como la dieta alta en grasas (HFD) que requieren hasta 16 y 20 semanas para desarrollarse¹⁴. Este modelo tarda cuatro semanas en desarrollarse e imita las anomalías metabólicas en los seres humanos. Por lo tanto, la reproducibilidad de este modelo es esencial.

Es imperativo garantizar la preparación y administración exhaustivas de AAV9-cTnT-LDLR y P-407. La replicabilidad de este modelo depende en gran medida de cálculos precisos de las concentraciones y dosis de P-407 y AAV9-cTnT-LDLR, así como de mediciones de peso. Igualmente importantes son las preparaciones de la solución y las técnicas adecuadas de inyección intravenosa e intraperitoneal. Las desviaciones en estas técnicas pueden dar lugar a alteraciones significativas y resultados no deseados.

A pesar de la eficacia y eficiencia de este modelo, existen varias limitaciones. Se necesita un entrenamiento riguroso para realizar inyecciones intravenosas e intraperitoneales. Además, existe un riesgo potencial de morbilidad y mortalidad asociado con las inyecciones intravenosas y frecuentes intraperitoneales. Al realizar inyecciones intravenosas, pueden producirse lesiones en la cola del ratón, mientras que con las inyecciones intraperitoneales puede producirse una punción cecal, lo que conduce a la peritonitis¹⁵. Estas lesiones suelen deberse a técnicas incorrectas y pueden resultar en la pérdida de sujetos experimentales y tratamiento. Por lo tanto, es necesaria una amplia capacitación antes de realizar estos procedimientos. Otra limitación es el enfoque de este modelo en la cepa 129J. La razón detrás de la elección de la cepa 129J se deriva de estudios preliminares que arrojaron hallazgos más rápidos de disfunción diastólica e ICFEP en esta cepa en comparación con los ratones C57BL/6 que estudiamos inicialmente en investigaciones no publicadas.

Independientemente de estas limitaciones, este modelo permitirá investigaciones más rápidas sobre los mecanismos subyacentes implicados en la ICFEP y las posibles opciones de tratamiento eficaces. Estudios previos han llevado al desarrollo de un modelo fisiopatológico para la HFD cardiometabólica inducida por HFpEF y el éster metílico de N[w]-nitro-l-arginina (L-NAME) durante 5-15 semanas¹³. Sin embargo, debido al aumento constante de la prevalencia de la ICFEP, existe una necesidad urgente de comprender mejor la fisiopatología de la ICFEP cardiometabólica y de desarrollar una terapia eficaz. Este modelo murino de hiperlipidemia cardíaca inducida por LDLR OE y p407 es un método rápido y factible de inducir HFpEF cardiometabólica para futuros esfuerzos de investigación.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)	U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP)		Transgene plasmids and AAVs particles were generated by the U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP). AAV were provided in Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) with 0.001% Pluronic F68. The Core determined AAV titers by digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR) and assessed all preparations for capsid protein ratio by SDS-PAGE and for the presence of endotoxin. Constructs include the human (h) transcripts tagged by 3X HA, Penn Vector Core (RRID: SCR_022432). AAV9-cTNT-hLDLR plasmid encodes the full human LDLR protein (2664bp).
Imaging systems with a high frequency transducer probe MS400	(VisualSonics, Toronto, ON, Canada)	Vevo 2100 or 3100
Isoflurane	Akorn Animal Health, Inc.	NDC: 59399-106-01
LabChart  software	ADInstruments	Pro version 8.1.5
Poloxamer 407	Sigma-Aldrich	16758
PV catheter	Millar Instrument	PVR 1035
Ultrasound analysis software	Vevo Lab
Wild-type (WT) mice on 129J background	Jackson Laboratory