Caracterización de sistemas de eflujo de múltiples fármacos en Acinetobacter baumannii utilizando una cepa bacteriana deficiente en eflujo y un sistema de expresión génica de copia única

Resumen

Describimos un procedimiento sencillo para la complementación cromosómica de una sola copia de un gen de bomba de eflujo utilizando un sistema de expresión basado en mini-Tn7 en una cepa de Acinetobacter baumannii deficiente en eflujo modificada. Esta precisa herramienta genética permite controlar la expresión génica, lo cual es clave para la caracterización de las bombas de eflujo en patógenos multirresistentes.

Resumen

Acinetobacter baumannii es reconocido como un patógeno gramnegativo desafiante debido a su resistencia generalizada a los antibióticos. Es crucial comprender los mecanismos detrás de esta resistencia para diseñar opciones terapéuticas nuevas y efectivas. Desafortunadamente, nuestra capacidad para investigar estos mecanismos en A. baumannii se ve obstaculizada por la escasez de herramientas adecuadas de manipulación genética. Aquí, describimos métodos para utilizar un sistema basado en mini-Tn7 cromosómico para lograr la expresión génica de una sola copia en una cepa de A. baumannii que carece de mecanismos funcionales de eflujo de tipo RND. La inserción de copia única y la expresión de la bomba de eflujo inducible son bastante ventajosas, ya que la presencia de operones de eflujo de RND en plásmidos de alto número de copias a menudo es mal tolerada por las células bacterianas. Además, la incorporación de vectores de expresión de mini-Tn7 recombinantes en el cromosoma de un huésped sustituto de A. baumannii con mayor sensibilidad al eflujo ayuda a evitar la interferencia de otras bombas de eflujo. Este sistema es valioso no solo para investigar bombas de eflujo bacteriano no caracterizadas, sino también para evaluar la eficacia de los inhibidores potenciales dirigidos a estas bombas.

Introducción

Acinetobacter baumannii es un patógeno prioritario de la Organización Mundial de la Salud debido a su amplia resistencia a todas las clases de antibióticos¹. Es un patógeno oportunista que afecta principalmente a personas hospitalizadas, lesionadas o inmunodeprimidas. A. baumannii evade en gran medida los antibióticos a través de bombas de eflujo, siendo la más relevante la familia de exportadores Resistance-Nodulation-Division (RND)². Comprender cómo funcionan mecánicamente estas bombas de eflujo permitirá desarrollar opciones terapéuticas específicas.

Una forma com....

Protocolo

1. Preparación experimental

1. Purificar el plásmido pUC18T-mini-Tn7T-LAC-Gm⁹ (plásmido de inserción, Figura 2A) con el gen de interés.
   NOTA: Aquí, el gen de interés es adeIJK. La concentración final del plásmido debe ser de ≥100 ng/μL.
2. Purificar el plásmido auxiliar (pTNS2)⁹ y el plásmido de escisión (pFLP2^ab)⁶ (Figura 2B, C, respectivamente), idealmente hasta una concentración final de ADN plasmídico de ≥100 ng/μL.
3. Prepare 50 ml de agua ultrapura estéril....

Discusión

A pesar de que este procedimiento para la inserción cromosómica de un sistema de expresión génica inducible de una sola copia en A. baumannii es técnicamente sencillo y no requiere mucha mano de obra, hay algunos pasos importantes que deben enfatizarse. En primer lugar, la preparación de las células competentes debe realizarse en hielo tanto como sea posible, ya que las células se vuelven frágiles durante la sustitución de los medios por agua helada. Idealmente, los pasos de centrifugación se realizan.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tube	VWR	20170-012	For colony boil preparations and PCR reactions
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72-690-301	General use
13-mL culture tubes, Pyrex	Fisher	14-957K	Liquid culture vessels
6x DNA loading buffer	Froggabio	LD010	Agarose gel electrophoresis sample loading dye
Acetic acid, glacial	Fisher	351271-212	Agarose gel running buffer component
Agar	Bioshop	AGR003	Solid growth media
Agarose	BioBasic	D0012	Electrophoretic separation of PCR reaction products; used at a concentration of 0.8–2%
Agarose gel electrophoresis unit	Fisher	29-237-54	Agarose gel electrophoresis; separation of PCR reaction products
Carbenicillin	Fisher	50841231	Selective media
Culture tube closures	Fisher	13-684-138	Stainless steel closure for 13-mL culture tubes
Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) set	Biobasic	DD0058	PCR reaction component; supplied as 100 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP; mixed and diluted for 10 mM each dNTP
Dry bath/block heater	Fisher	88860023	Isotemp digital dry bath for boil preparations
Electroporation cuvettes	VWR	89047-208	2 mm electroporation cuvettes with round cap
Electroporator	Cole Parmer	940000009	110 VAC, 60 Hz electroporator
Ethidium bromide	Fisher	BP102-1	Visualization of PCR reaction products and DNA marker in agarose gel
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	VWR	CA-EM4050	Agarose gel running buffer component
Gentamicin	Biobasic	GB0217	For the preparation of selective media
Glycerol	Fisher	G33	Preparation of bacterial stocks for long-term storage in an ultra-low freezer
Incubator (shaking)	New Brunswick Scientific	M1352-0000	Excella E24 Incubator Shaker for liquid culture growth
Incubator (static)	Fisher	11-690-550D	Isotemp Incubator Oven Model 550D for solid (LB agar) culture growth
Inoculation loop	Sarstedt	86.1562.050	Streaking colonies onto agar plates
Inoculation spreader	Sarstedt	86.1569.005	Spreading of culture onto agar plates
Lysogeny broth (LB) broth, Lennox	Fisher	BP1427	Liquid growth media (20 g/L: 5 g/L sodium chloride, 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract)
Microfuge	Fisher	75002431	Sorvall Legend Micro 17 for centrifugation of samples
Mini-centrifuge	Fisher	S67601B	Centrifugation of 0.2 mL PCR tubes
Petri dishes	SPL Life Sciences	10090	For solid growth media (agar plates): 90 x 15 mm
Pipettes	Mandel	Various	Gilson single channel pipettes (P10, P20, P200, P1000)
Power supply	Biorad	1645050	PowerPac Basic power supply for electrophoresis
Primers	IDT	NA	PCR reaction component; specific to gene of interest; prepared at 100 μM as directed on the product specification sheet
Sucrose	BioBasic	SB0498	For the preparation of counterselective media for removal of the pFLP2ab plasmid from transformed A. baumannii
Taq DNA polymerase	FroggaBio	T-500	PCR reaction component; polymerase supplied with a 10x buffer
Thermal cycler	Biorad	1861096	Model T100 for PCR
Toothpicks	Fisher	S24559	For patching colonies onto agar plates
Trizma base	Sigma	T1503	Agarose gel running buffer component
Ultrapure water	Millipore Sigma	ZLXLSD51040	MilliQ water purification system: ultra pure water for media and solution preparation, and cell washing
Wide range DNA marker	Biobasic	M103R-2	Size determination of PCR products on an agarose gel
Wooden inoculating sticks	Fisher	29-801-02	Inoculating cultures with colonies from agar plates