Hemostasia de heridas punzantes y preparación de muestras para el análisis de microscopía electrónica de área amplia montada

Resumen

Aquí se presenta un procedimiento de herida punzante para la formación de trombos hemostáticos. Los trombos formados son grandes y tienen cientos de micras de diámetro. Por lo tanto, los enfoques de imágenes de volumen son apropiados. Sugerimos la microscopía electrónica de transmisión de área amplia montada como un enfoque de alta resolución disponible para muchos y detallamos un protocolo preparativo.

Resumen

La hemostasia, el proceso de control fisiológico normal del daño vascular, es fundamental para la vida humana. Todos sufrimos pequeños cortes y heridas punzantes de vez en cuando. En la hemostasia, la agregación plaquetaria autolimitada conduce a la formación de un trombo estructurado en el que el cese del sangrado proviene de tapar el orificio desde el exterior. La caracterización detallada de esta estructura podría conducir a distinciones entre hemostasia y trombosis, un caso de agregación plaquetaria excesiva que conduce a la coagulación oclusiva. Aquí se presenta un enfoque basado en imágenes para la estructura del trombo de la herida punzante que se basa en la capacidad de la microscopía electrónica de sección delgada para visualizar el interior de los trombos hemostáticos. El paso más básico en cualquier protocolo experimental basado en imágenes es una buena preparación de la muestra. El protocolo proporciona procedimientos detallados para la preparación de heridas punzantes y trombos ricos en plaquetas en ratones para su posterior microscopía electrónica. Se proporciona un procedimiento detallado para la fijación in situ del trombo de la herida punzante en formación y su posterior procesamiento para la tinción y la inclusión para microscopía electrónica. La microscopía electrónica se presenta como la técnica de imagen final debido a su capacidad, cuando se combina con el corte secuencial, para visualizar los detalles del interior del trombo a alta resolución. Como método de imagen, la microscopía electrónica proporciona un muestreo imparcial y un resultado experimental que escala de nanómetros a milímetros en 2 o 3 dimensiones. Se cita un software de microscopía electrónica gratuito apropiado que admita la microscopía electrónica de área amplia en la que se pueden combinar cientos de fotogramas para proporcionar imágenes a escala nanométrica de secciones transversales completas de trombos de heridas punzantes. Por lo tanto, cualquier subregión del archivo de imagen se puede colocar fácilmente en el contexto de la sección transversal completa.

Introducción

La formación de un trombo punzante que conduce al cese de la hemorragia es uno de los eventos más esenciales en la vida¹. Sin embargo, a pesar de esa esencialidad, el conocimiento de lo que ocurre estructuralmente durante la formación de trombos, ya sea en una vena, una arteria, un evento aterosclerótico o un coágulo oclusivo, ha sido limitado por la resolución y la profundidad de las imágenes. La microscopía óptica convencional tiene una profundidad limitada en comparación con un trombo de herida punzante completamente formado, de 200 a 300 μm en Z¹, y en un nivel de resolución cuando s....

Protocolo

Los experimentos fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas. Aquí, se utilizaron ratones C57BL/6 machos y hembras de 8 a 12 semanas de edad, de tipo salvaje. Estos ratones son adultos jóvenes con poca acumulación de grasa. Los mismos procedimientos son aplicables a ratones mutantes para diversas proteínas importantes para la hemostasia, como el factor de von Willebrand o la glicoproteína VI plaquetaria (GPVI)^5,6. Todos los equipos, instrumentos quirúrgicos, reactivos y otros ....

Resultados

Cuantificación de los efectos del fármaco sobre el tiempo de sangrado de la herida punzante
Los tiempos de sangrado de las heridas punzantes proporcionan un modelo fisiológico del riesgo de un fármaco que puede llevarse a cabo fácilmente en ratones. Los resultados que se derivan de un experimento de herida punzante son predictivos. Aquí, mostramos una curva de sangrado dosis-respuesta de dabigatán. El dabigatrán, un inhibidor de la trombina, se utiliza como an.......

Discusión

Presentamos un procedimiento detallado de heridas punzantes para la producción de trombos hemostáticos en venas yugulares y arterias femorales, su fijación de perfusión in situ y el procesamiento de muestras para microscopía electrónica de transmisión de área amplia montada. Los procedimientos generales son útiles para generar trombos hemostáticos para el análisis ultraestructural y para comparar los tiempos de sangrado en ratones experimentales, por ejemplo, ratones .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000