Hemostasia de heridas punzantes y preparación de muestras para el análisis de microscopía electrónica de área amplia montada

Resumen

Aquí se presenta un procedimiento de herida punzante para la formación de trombos hemostáticos. Los trombos formados son grandes y tienen cientos de micras de diámetro. Por lo tanto, los enfoques de imágenes de volumen son apropiados. Sugerimos la microscopía electrónica de transmisión de área amplia montada como un enfoque de alta resolución disponible para muchos y detallamos un protocolo preparativo.

Resumen

La hemostasia, el proceso de control fisiológico normal del daño vascular, es fundamental para la vida humana. Todos sufrimos pequeños cortes y heridas punzantes de vez en cuando. En la hemostasia, la agregación plaquetaria autolimitada conduce a la formación de un trombo estructurado en el que el cese del sangrado proviene de tapar el orificio desde el exterior. La caracterización detallada de esta estructura podría conducir a distinciones entre hemostasia y trombosis, un caso de agregación plaquetaria excesiva que conduce a la coagulación oclusiva. Aquí se presenta un enfoque basado en imágenes para la estructura del trombo de la herida punzante que se basa en la capacidad de la microscopía electrónica de sección delgada para visualizar el interior de los trombos hemostáticos. El paso más básico en cualquier protocolo experimental basado en imágenes es una buena preparación de la muestra. El protocolo proporciona procedimientos detallados para la preparación de heridas punzantes y trombos ricos en plaquetas en ratones para su posterior microscopía electrónica. Se proporciona un procedimiento detallado para la fijación in situ del trombo de la herida punzante en formación y su posterior procesamiento para la tinción y la inclusión para microscopía electrónica. La microscopía electrónica se presenta como la técnica de imagen final debido a su capacidad, cuando se combina con el corte secuencial, para visualizar los detalles del interior del trombo a alta resolución. Como método de imagen, la microscopía electrónica proporciona un muestreo imparcial y un resultado experimental que escala de nanómetros a milímetros en 2 o 3 dimensiones. Se cita un software de microscopía electrónica gratuito apropiado que admita la microscopía electrónica de área amplia en la que se pueden combinar cientos de fotogramas para proporcionar imágenes a escala nanométrica de secciones transversales completas de trombos de heridas punzantes. Por lo tanto, cualquier subregión del archivo de imagen se puede colocar fácilmente en el contexto de la sección transversal completa.

Introducción

La formación de un trombo punzante que conduce al cese de la hemorragia es uno de los eventos más esenciales en la vida¹. Sin embargo, a pesar de esa esencialidad, el conocimiento de lo que ocurre estructuralmente durante la formación de trombos, ya sea en una vena, una arteria, un evento aterosclerótico o un coágulo oclusivo, ha sido limitado por la resolución y la profundidad de las imágenes. La microscopía óptica convencional tiene una profundidad limitada en comparación con un trombo de herida punzante completamente formado, de 200 a 300 μm en Z¹, y en un nivel de resolución cuando se compara con el tamaño de los orgánulos plaquetarios y su espaciamiento, a menudo inferior a 30 nm². La microscopía de luz de dos fotones puede producir la profundidad necesaria de imágenes, pero no mejora significativamente la resolución. Los avances más recientes en microscopía óptica, por ejemplo, las técnicas de superresolución, siguen siendo de resolución limitada, en la práctica ~20 nm en XY y el doble en Z, y de profundidad, no más que la microscopía óptica convencional. Además, la microscopía óptica de superresolución, al igual que gran parte de la microscopía óptica de investigación, se basa en la microscopía de fluorescencia, una técnica que está inherentemente sesgada a un pequeño conjunto de proteínas candidatas para las que existen buenos anticuerpos o buenas construcciones marcadas³. En conclusión, la microscopía electrónica de barrido convencional puede, a lo sumo, visualizar la superficie del trombo rico en plaquetas en formación.

Para superar estas limitaciones técnicas a la hora de caracterizar la estructura del trombo, teníamos tres objetivos. En primer lugar, producir de forma reproducible una herida punzante definida en una vena o arteria de ratón que luego podría estabilizarse fácilmente in situ mediante fijación química. En segundo lugar, aplicar un procedimiento preparatorio que haga hincapié en la preservación de la membrana, un objetivo coherente con el objetivo de definir la posición de las plaquetas individuales dentro del trombo en formación. En tercer lugar, utilice una técnica de visualización imparcial que, en una sola imagen, pueda escalarse entre nanómetros y casi milímetros.

La microscopía electrónica de área amplia montada se eligió como una técnica importante de visualización final por una sola razón importante: en las imágenes de microscopio electrónico, se ve una amplia gama de características dentro de una célula que delinea sus orgánulos y características dentro de los orgánulos. Se pueden reconocer objetos pequeños como los ribosomas. Esta gama de características se debe a que las manchas de metales pesados densos en electrones, uranilo, plomo y osmio, que se utilizan para la microscopía electrónica para producir contraste, se unen a una amplia gama de moléculas. En una imagen de microscopio electrónico, se ve gran parte de lo que hay allí, mientras que con los enfoques de inmunofluorescencia y marcaje de proteínas, solo se ve lo que se ilumina. Esto significa, por ejemplo, los sitios de antígenos presentes en una especie de proteína individual dada. En el caso de una molécula marcada, a menudo una proteína, es el sitio o sitios donde se encuentra esa proteína. Todas las demás moléculas son oscuras y no están iluminadas. Sin embargo, ¿es práctica esta elección de microscopía electrónica? Un trombo de herida punzante tiene un tamaño de 300 por 500 μm y, con un tamaño de píxel de 3 nm, es una imagen de 100.000 por 167.000 píxeles. Una cámara de microscopio electrónico de alta calidad tiene 4000 por 4000 píxeles. Eso significa que se deben unir/mezclar aproximadamente 1000 fotogramas para obtener una sola imagen. Esa es una posibilidad que ha estado presente en la mayoría de los microscopios electrónicos fabricados en los últimos 15 años. La platina del microscopio está computarizada y las imágenes se pueden unir con una computadora. Esa es la lógica que llevó a las decisiones que subyacen a la formulación del protocolo presentado.

De manera concluyente, presentamos a continuación una serie de pasos que dan una herida reproducible en la vena o arteria de ratones que luego, siguiendo los pasos de fijación in situ y los pasos posteriores de inclusión, se puede visualizar mediante microscopía electrónica de transmisión de área amplia montada a escala de nm y en la imagen cosida visualizada a escala cercana a mm, la escala de la real in situ Trombo fijo. La escalabilidad de este tipo es necesaria para comprender la formación de trombos como un problema en hematología/salud y como un sistema de biología del desarrollo en el que las plaquetas son el principal tipo de célula. Estos avances ofrecen una gran virtud de la microscopía electrónica, a saber, que uno ve lo que está ahí, no solo lo que se ilumina. Para un protocolo detallado sobre la preparación de muestras para microscopía electrónica de barrido de cara a bloque en serie (SBF-SEM), se remite al lector a un artículo reciente de Joshi et ^al.4.

Protocolo

Los experimentos fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas. Aquí, se utilizaron ratones C57BL/6 machos y hembras de 8 a 12 semanas de edad, de tipo salvaje. Estos ratones son adultos jóvenes con poca acumulación de grasa. Los mismos procedimientos son aplicables a ratones mutantes para diversas proteínas importantes para la hemostasia, como el factor de von Willebrand o la glicoproteína VI plaquetaria (GPVI)^5,6. Todos los equipos, instrumentos quirúrgicos, reactivos y otros materiales utilizados se muestran en la Figura 1 y se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Herida punzante de la vena yugular/arteria femoral ^1,7

1. Anestesia del ratón
   1. Coloque el ratón en la cámara de inducción y gire el vaporizador de isoflurano a un ajuste de caudal alto (500 mL/min, 3% de isoflurano). Se elige el isoflurano porque tiene poco efecto sobre el diámetro de los vasos sanguíneos.
      PRECAUCIÓN: La exposición prolongada al isoflurano puede causar efectos adversos para la salud. El uso de un vaporizador de bajo flujo, botes de captura de gas de anestesia y una buena ventilación de la habitación pueden reducir en gran medida la exposición.
   2. Cuando el ratón parezca dormido, pellizque uno de los dedos del ratón para ver si reacciona. Si es así, vuelva a colocar el ratón en la cámara de inducción durante unos minutos y vuelva a intentar la prueba de pellizco. Si el ratón no reacciona, colóquelo en posición supina sobre la placa calefactora (previamente cubierta con papel de aluminio).
   3. Baja el vaporizador a un caudal bajo (100 mL/min, 1,75% de isoflurano). Coloca la nariz del ratón en el cono de la nariz. Extienda cada extremidad y péguela con pequeños trozos de cinta adhesiva.
   4. Inserte la sonda de temperatura rectal y ajuste la temperatura a 37 °C en el controlador de temperatura. Pegue con cinta adhesiva el cable de la sonda de temperatura para evitar que la sonda se salga accidentalmente.
2. Incisión de ratón
   1. Con las tijeras, afeita el cuello y el pecho del ratón (para la vena yugular) o la parte interna de la pierna derecha (para la arteria femoral). Limpia los recortes de piel con una almohadilla con alcohol. Si es necesario, vuelva a repasar el área con la maquinilla para eliminar el pelaje restante.
   2. Limpie el área nuevamente con una almohadilla con alcohol nueva para eliminar todos los recortes. Es muy importante que la zona esté lo más limpia posible. Confirme el plano quirúrgico de la anestesia a través de un pellizco en el dedo del pie.
   3. Con unas tijeras y unas pinzas romas, levante y corte la piel sobre la vena yugular derecha. Corta una ventana redonda en la piel lo suficientemente grande como para exponer la vena yugular y parte del tejido circundante.
3. Limpieza de la vena yugular (los mismos principios se aplican a la arteria femoral)
   1. Con la técnica de disección roma, empuje suavemente a un lado los ganglios adiposos y linfáticos, así como el tejido conectivo.
      NOTA: En este paso se lleva a cabo una limpieza general alrededor de la embarcación; Sin embargo, se llevará a cabo una limpieza cuidadosa y exhaustiva bajo el microscopio después de que la vena yugular se fije en paraformaldehído durante 24 horas.
   2. Llene una jeringa de 20 ml con solución salina normal calentada a 37 °C. Cargue la jeringa en la bomba de infusión de jeringa. Conecte la aguja de mariposa de 27 G y el tubo asociado a la jeringa.
   3. Ajuste la bomba de jeringa a un caudal de 0,5 mL/min. El suave chorro de solución salina lavará la sangre de la vena/arteria perforada. Coloque el chorro de solución salina unos pocos mm a un lado del sitio de punción, no directamente sobre él.
4. Perforación de la vena yugular/arteria femoral
   1. Inicie el temporizador. Obtener una aguja hipodérmica de 30G (diámetro nominal de 300 μm) para la vena yugular y una aguja hipodérmica de 33G (200 μm de diámetro) para la arteria femoral. El uso de una aguja más pequeña proporciona solo un tiempo de sangrado ligeramente más largo para la situación arterial de presión más alta.
   2. Gira el bisel hacia arriba. Coloque la aguja en un ángulo de 25° sobre la vena yugular/arteria femoral. Fíjate en la hora.
   3. Perfore rápidamente el recipiente, asegurándose de perforar solo la parte superior del recipiente. Tenga cuidado de no perforar también el fondo del recipiente. Fíjate en el momento en que el sangrado se detiene por completo.
   4. Espere el tiempo adecuado para obtener la formación de trombo (Figura 2A) antes de iniciar la fijación de la perfusión (es decir, 1, 5, 10 o 20 minutos para obtener diferentes etapas de desarrollo del trombo). Aplicar la eutanasia al animal por exanguinación o seguir las directrices institucionales locales para la eutanasia.
5. Realización de la fijación de la perfusión transcárdica
   1. Instale la bomba peristáltica antes de que comience la cirugía. Coloque dos tubos cónicos de 50 mL en una gradilla para tubos de ensayo. Llene un tubo con una solución fijadora de paraformaldehído al 4% preparada en una solución tampón de cacodilato de sodio (0,2 M de cacodilato de sodio, 0,15 M de cloruro de sodio a pH 7,4) para estudios de punción yugular y llene el otro tubo con una solución tampón de cacodilato de sodio.
      NOTA: Las condiciones detalladas aquí son suficientes para el caso de baja presión de la yugular y luego se modifican para el caso de mayor presión de una arteria. Para los estudios de sistemas de alta presión con arterias, es decir, la arteria femoral, el fijador de paraformaldehído se complementa con glutaraldehído al 0,1%, y la fijación por goteo externo se combina con la fijación por perfusión.
   2. Coloque el extremo de absorción del tubo de la bomba en el tubo que contiene la solución tampón. Conecte una aguja de mariposa de 27 G con un tubo asociado al extremo de salida del tubo de la bomba y coloque la aguja en un vaso de precipitados limpio.
   3. Ajuste la bomba peristáltica a un caudal de 10 mL/min. Encienda la bomba de perfusión.
   4. Cuando la solución tampón comience a fluir de la aguja al vaso de precipitados, apague la bomba. El tubo y la aguja ahora están preparados para la perfusión transcárdica.
   5. Exponga la cavidad torácica haciendo un corte en la línea media de la piel desde la parte superior del esternón hasta unos pocos milímetros más allá de la parte inferior del esternón con tijeras de disección y pinzas romas. Haga incisiones transversales a lo largo de la base de la caja torácica, comenzando en la línea media y cortando de medial a lateral a cada lado.
   6. Inmediatamente antes de iniciar la perfusión transcárdica, corte rápidamente la caja torácica y refleje cada lado para exponer el corazón.
   7. Encienda la bomba peristáltica. Coloque la punta de la aguja de mariposa de 27 g en la base del ventrículo izquierdo.
   8. Mientras sostienes la aguja firmemente en el ventrículo izquierdo, haz una hendidura en la aurícula derecha con unas tijeras diseccionadoras afiladas para permitir que la sangre y el líquido de perfusión fluyan. Anote la hora en el temporizador.
   9. Perfundir con solución tampón durante 3 minutos para eliminar la sangre del sistema circulatorio. Mientras mantiene la aguja segura en el ventrículo izquierdo, apague la bomba peristáltica y mueva el extremo de absorción del tubo de la bomba peristáltica al tubo de 50 ml que contiene la solución fijadora.
   10. Anote la hora en el temporizador. Vuelva a encender la bomba peristáltica y perfunde con la solución fijadora durante 7 min. Apague la bomba peristáltica.
   11. Retire la aguja del ventrículo izquierdo y colóquela en un vaso de precipitados. Coloque el extremo de absorción del tubo de la bomba en un vaso de precipitados con agua destilada.
   12. Encienda la bomba peristáltica y deje que fluyan aproximadamente 20 ml de agua a través del tubo y salgan por la aguja de 27G hacia el vaso de precipitados para limpiar el tubo. Asegúrese de dejar que toda el agua salga por el tubo y la aguja antes de apagar la bomba.

2. Recogida de muestras para microscopía electrónica

1. Después de la fijación por perfusión suplementada con un fijador externo inicial de 2 min en el caso de heridas punzantes por punción de la arteria femoral, diseccionar cuidadosamente la porción de la vena yugular/arteria femoral que contiene el sitio de punción y el trombo (Figura 2A). Con unas tijeras afiladas, haga un corte diagonal a través del extremo distal del segmento del vaso y haga un corte recto a través del extremo proximal del segmento del vaso.
   NOTA: Hacer cortes de esta manera ayuda a orientar el vaso más tarde y a identificar la dirección del flujo sanguíneo en el vaso.
2. Sumerja el segmento del recipiente en paraformaldehído al 4% fresco a temperatura ambiente en una solución tampón de cacodilato de sodio (cacodilato de sodio 0,2 M, cloruro de sodio 0,15 M a pH 7,4) y colóquelo a temperatura ambiente durante 1 h.
3. Transfiera el tejido fijo a 4 °C durante 24 h. Al día siguiente, tome una placa de cultivo de 35 mm que contenga una esterilla de silicona de ~ 5 mm de grosor (preparada de antemano de acuerdo con las instrucciones del fabricante). Vierta suficiente solución tampón de cacodilato de sodio en el plato para sumergir el segmento de vena fija.
4. Mientras observa bajo un microscopio óptico (~15 aumentos), transfiera con cuidado el tejido al plato de 35 mm que contiene la solución tampón y fije cada extremo del recipiente a la estera de silicona con alfileres de acero inoxidable y pinzas finas.
5. Limpie cuidadosamente el segmento de la vena yugular/arteria femoral con unas microtijeras y unas pinzas muy finas.
   1. Solo para la vena yugular: Retire uno de los clavos y, con las microtijeras, corte longitudinalmente la pared del vaso opuesta al sitio de la punción/trombo. Abra suavemente el recipiente y, con 4 a 5 alfileres (cada uno cortado por la mitad con cortadores de alambre), sujételo a la estera de silicona con el lado intraluminal hacia arriba.
6. Aspire la solución tampón, reemplácela rápidamente con una solución de paraformaldehído al 1% en una solución tampón de cacodilato de sodio y coloque la tapa en el plato. No deje que el tejido se seque en ningún momento. Manténgalo siempre sumergido en líquido.
7. Almacene el tejido a 4 °C hasta que sea el momento de procesarlo para microscopía electrónica (Figura 2B). Procese algunas de las muestras de la herida punzante de la vena yugular/arteria femoral para la obtención de imágenes mediante SBF-SEM⁴ y otras para la obtención de imágenes mediante WA-TEM ^8,9. Los pasos de WA-TEM se describen en detalle a continuación.
   PRECAUCIÓN: Realice todos los trabajos que involucren formaldehído, óxido de propileno, OsO₄ y 2,4,6-Tris(dimetilaminometil)fenol (DMP-30) en una campana de gases químicos. Estos son productos químicos peligrosos. La exposición al OsO₄ puede causar ceguera y la muerte.
   NOTA: Todos los volúmenes de enjuague y tinción son al menos 2 veces el volumen de la muestra. La solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x puede sustituirse por el tampón de cacodilato de sodio de 0,1 M. Durante el procedimiento de fijación, es muy importante no dejar nunca que las muestras se sequen, ya que esto afectaría significativamente a la ultraestructura. Utiliza tubos de polipropileno.

3. Preparación de la muestra para microscopía electrónica de transmisión de área amplia montada (WA-TEM)

NOTA: Este paso representa un punto de decisión en el que el investigador se compromete a prepararse para WA-TEM. Este procedimiento preparatorio no es compatible con SBF-SEM. Para SBF-SEM volumen EM, todas las tinciones deben realizarse antes de incrustar en plástico. Consulte el^{punto 4} para obtener un protocolo de preparación SBF-SEM.

1. Lave la muestra de tejido en el plato de 35 mm 2 veces con la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) o PBS a temperatura ambiente (RT). Mantenga la muestra anclada, lo que permite rastrear la orientación de la muestra a través de estos pasos preparativos.
2. Fijar con 0,8 mL de verde de malaquita al 0,05%/2,5% de glutaraldehído/cacodilato de sodio al 0,1 M (pH 6,7 - 7,0) durante 20 min en hielo.
3. Retire el fijador y lave la muestra 4 veces durante 5 minutos cada una con cacodilato de sodio 0,1 M. Retire el cacodilato de sodio 0,1 M.
4. Postfijo con 0,8 mL de 0,8% K₃Fe(CN)₆ o K₄Fe(CN)₆ / 1,0% OsO₄ K₃Fe(CN)₆ en cacodilato de sodio 0,1 M. Coloque una tapa sobre el plato para mantener la luz fuera (OsO₄ es sensible a la luz). Teñir durante 20 min a 1 h en RT.
5. Retire el OsO₄ y enjuague 4 veces durante 5 minutos cada una con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M. Retire el tampón de cacodilato de sodio y tiña con ácido tánico al 1% durante 20 minutos en hielo.
6. Retire el ácido tánico y lave durante 5 minutos con tampón de cacodilato de sodio 0,1 M 1x y 2x durante 5 minutos cada uno con agua destilada (DI) de grado molecular.
7. Teñir con acetato de uranilo (UA) al 0,5% durante 1 h RT o toda la noche a 4 °C en la oscuridad.
8. Retire el acetato de uranilo y enjuague 5 veces durante 5 minutos cada una con agua destilada de grado molecular. Antes del último lavado y mientras la muestra aún está sumergida en agua desionizada, corte la alfombrilla de silicona alrededor de la muestra sujeta con una cuchilla de afeitar. Levanta este pequeño trozo de estera de silicona de la placa y colócalo en un tubo de polipropileno.
   NOTA: Es importante que la muestra permanezca fijada a la pieza de silicona mientras esté en el tubo. Es necesario cambiar a tubos de polipropileno en este paso porque el óxido de propileno utilizado en los pasos posteriores degradará el poliestireno de las placas de 35 mm.
9. Después de quitar el último tampón, enjuague brevemente 1 vez con etanol al 25%. Deseche el etanol al 25% e incube con etanol al 25% durante 3 minutos en hielo.
10. Retire el etanol al 25%. Enjuague brevemente 1 vez con etanol al 50%. Deseche el etanol al 50% e incube con etanol al 50% durante 3 minutos en hielo.
11. Retire el etanol al 50% y enjuague brevemente 1 vez con etanol al 75%. Deseche el etanol al 75% e incube con etanol al 75% durante 3 minutos en hielo.
12. Retire el etanol al 75% y enjuague brevemente 1 vez con etanol al 95%. Deseche el etanol al 95% e incube con etanol al 95% durante 3 minutos en hielo.
13. Retire el etanol al 95% y lave 3 veces, al menos 10 minutos cada vez, con etanol al 100% (200 grados). Retire el etanol al 100% y agregue óxido de propileno (PO). Enjuague 3 veces al menos 10 minutos cada una, con PO.
14. Prepara la mezcla de resina como se describe a continuación.
    1. Calentar los componentes de la resina a 60 °C para licuarlos completamente. Mezcle bien 12,5 mL de Embed-218, 7,5 mL de Araldite 502 y 27,5 mL de DDSA en un tubo de 50 mL a 60 °C. Esta mezcla se puede conservar durante 6 meses a 4 °C. Calentar a 60 °C antes de usarlo. Alícuota la cantidad requerida antes de su uso.
15. Incruste los ejemplos como se describe a continuación.
    1. Coloque una alícuota de la mezcla de resina en un tubo y agregue 20 μL/mL de activador DMP-30. Mezclar bien girando a 60 °C; El color debe oscurecerse.
    2. Diluya esta alícuota de resina activada en un 50% en PO y deje que la resina y el PO se mezclen completamente.
    3. Retire el último enjuague de PO del tubo que contiene la muestra y reemplácelo con la mezcla de 50% de resina / PO, llenando casi por completo el tubo. Gire la muestra durante la noche a temperatura ambiente.
    4. Al día siguiente, mezclar una nueva alícuota de resina (1 mL por muestra) con 20 μL/mL de DMP-30.
16. Coloque la muestra en un plato de polipropileno con un pequeño volumen de mezcla de resina/PO al 50% del tubo de muestra bajo un microscopio de disección (~6x aumento) y retire con cuidado los alfileres del tejido. Transfiera solo el tejido a otro plato de polipropileno que contenga una pequeña cantidad de resina 100% con un activador DMP-30.
17. Llene un molde de inclusión de silicona con el 100% de resina con el activador DMP-30 y coloque cuidadosamente la muestra en el molde. Coloque el molde en el horno y hornee a 60 °C durante al menos 48 h . La muestra preparada se muestra en la Figura 2B.
18. Realice imágenes de microscopía electrónica de transmisión de área amplia (WA-TEM) montadas como se describe en^10,11. Consulte la Figura 3 para ver una representación del proceso que va desde una punción inicial hasta un trombo de 1 minuto renderizado en 3 dimensiones. La inclusión de un protocolo detallado para la obtención de imágenes de microscopía electrónica WA-TEM montadas no se incluye aquí y está más allá del alcance de los protocolos actuales sobre la preparación de muestras.
    NOTA: WA-TEM es una capacidad subestimada de la mayoría de los microscopios electrónicos de transmisión modernos con una platina computarizada. El software shareware que soporta estas funciones^10,11 está disponible en el grupo del Dr. David Mastronarde, de la Universidad de Colorado, Boulder (http://bio3d.colorado.edu/SerialEM/, http://bio3d.colorado.edu/imod/.)

Resultados

Cuantificación de los efectos del fármaco sobre el tiempo de sangrado de la herida punzante
Los tiempos de sangrado de las heridas punzantes proporcionan un modelo fisiológico del riesgo de un fármaco que puede llevarse a cabo fácilmente en ratones. Los resultados que se derivan de un experimento de herida punzante son predictivos. Aquí, mostramos una curva de sangrado dosis-respuesta de dabigatán. El dabigatrán, un inhibidor de la trombina, se utiliza como an...

Discusión

Presentamos un procedimiento detallado de heridas punzantes para la producción de trombos hemostáticos en venas yugulares y arterias femorales, su fijación de perfusión in situ y el procesamiento de muestras para microscopía electrónica de transmisión de área amplia montada. Los procedimientos generales son útiles para generar trombos hemostáticos para el análisis ultraestructural y para comparar los tiempos de sangrado en ratones experimentales, por ejemplo, ratones ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Normal Saline Solution	Medline	BHL2F7123HH
27G x 3/4 EXELint scalp vein set	Medline	NDA26709
30G x 1/2 EXELint hypodermic needles	Medline	NDA264372
33G x 1/2 EXELint specialty hypodermic needles	Medline	NDA26393
50 mL Conical Tubes	Fisher Scientific	06-443-20
Alcohol Prep Pads (70% Isopropyl Alcohol)	Medline	MDS090670Z
Aluminum Foil	Fisher Scientific	01-213-100
Animal Heating Plate	Physitemp Instruments	HP-1M
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Axiocam 305 Color R2 Microscopy Camera	Carl Zeiss Microscopy	426560-9031-000
BD Luer-Lok Syringes, 20 mL	Medline	B-D303310Z
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C79-500
Cell Culture Dishes 35mm x 10mm	Corning Inc.	430165
Cotton Tipped Applicators	Medline	MDS202055H
DMP-30 Activator	Electron Microscopy Sciences	13600
Dodecenyl Succinic Anhydride/ DDSA	Electron Microscopy Sciences	13700
Dressing Forceps, 5", curved, serrated, narrow tipped	Integra Miltex	6-100
Dressing Forceps, 5", standard, serrated	Integra Miltex	6-6
EMBED 812 Resin	Electron Microscopy Sciences	14900
Ethyl Alcohol, anhydrous 200 proof	Electron Microscopy Sciences	15055
Fisherbrand 4-Way Tube Rack	Fisher Scientific	03-448-17
Fisherbrand Digital Timer	Fisher Scientific	14-649-17
Fisherbrand Single Syringe Infusion Pump	Fisher Scientific	7801001
Gauze Sponges 2" x 2"- 4 Ply	Medline	NON26224H
Glutaraldehyde (10% Solution)	Electron Microscopy Sciences	16120
Isoflurane Liquid Inhalant Anesthesia, 100 mL	Medline	66794-017-10
Jeweler-Style Micro-Fine Forceps, Style 5F	Integra Miltex	17-305	Need 2 pairs.
L/S Pump Tubing, Silicone, L/S 15; 25 Ft	VWR	MFLX96410-15
L-Aspartic Acid	Fisher Scientific	BP374-100
Lead Nitrate	Fisher Scientific	L-62
Malachite Green 4	Electron Microscopy Sciences	18100
Masterflex L/S Easy-Load II Pump Head	VWR	MFLX77200-62
Masterflex L/S Variable Speed Digital Drive	VWR	MFLX07528-10
MSC Xcelite 5" Wire Cutters	Fisher Scientific	50-191-9855
Osmium Tetroxide 4% Aqueous Solution	Electron Microscopy Sciences	19150
Paraformaldehyde (16% Solution)	Electron Microscopy Sciences	15710
Physitemp Temperature Controller	Physitemp Instruments	TCAT-2LV
Potassium Ferrocyanide	Sigma-Aldrich	P-8131
Propylene Oxide, ACS Reagent	Electron Microscopy Sciences	20401
Pyrex Glass Beakers	Fisher Scientific	02-555-25B
Rectal Temperature Probe for Mice	Physitemp Instruments	RET-3
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000"	3M Company	305289
Sodium Cacodylate Buffer 0.2M, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	11623
SomnoFlo Low Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01
SomnoFlo Starter Kit for Mice	Kent Scientific	SF-MSEKIT
Stainless Steel Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-10
Stereomicroscope steREO Discovery.V12	Carl Zeiss Microscopy	495015-9880-010
Sylgard 184 Silicone Elastomer	World Precision Instruments	SYLG184	silicone mat
Tannic Acid	Electron Microscopy Sciences	21700
Thiocarbohydrazide (TCH)	Sigma-Aldrich	88535
Uranyl Acetate	Electron Microscopy Sciences	22400
Vannas Spring Micro Scissors	Fine Science Tools	15000-08
Von Graefe Eye Dressing Forceps, 2.75", Curved, Serrated	Integra Miltex	18-818	Need 2 pairs.
Wagner Scissors	Fine Science Tools	14068-12
Wahl MiniFigura Animal Trimmer	Braintree Scientific	CLP-9868
Zen Lite Software	Carl Zeiss Microscopy	410135-1001-000