Evaluación de las medidas de resultado de la conectividad de la unidad motora del diafragma de rata como biomarcadores cuantitativos de la degeneración y compensación de las neuronas motoras frénicas

Resumen

En este estudio, presentamos un método in vivo para estimar el número y el tamaño de la unidad motora para cuantificar la conectividad de la unidad motora de diafragma de rata. Se describe un enfoque paso a paso de estas técnicas.

Resumen

La pérdida de la función muscular ventilatoria es una consecuencia de la lesión de la neurona motora y la neurodegeneración (por ejemplo, lesión de la médula espinal cervical y esclerosis lateral amiotrófica, respectivamente). Las neuronas motoras frénicas son el eslabón final entre el sistema nervioso central y el músculo, y sus respectivas unidades motoras (grupos de fibras musculares inervadas por una sola neurona motora) representan la unidad funcional más pequeña del sistema ventilatorio neuromuscular. El potencial de acción muscular compuesto (CMAP), el potencial de unidad motora única (SMUP) y la estimación del número de unidades motoras (MUNE) son enfoques electrofisiológicos establecidos que permiten la evaluación longitudinal de la integridad de la unidad motora en modelos animales a lo largo del tiempo, pero se han aplicado principalmente a los músculos de las extremidades. Por lo tanto, los objetivos de este estudio son describir un enfoque en estudios preclínicos con roedores que se pueda utilizar longitudinalmente para cuantificar el MUNE frénico, el tamaño de la unidad motora (representado como SMUP) y CMAP, y luego demostrar la utilidad de estos enfoques en un modelo de pérdida de neuronas motoras. Los biomarcadores sensibles, objetivos y traslacionalmente relevantes para la lesión, degeneración y regeneración neuronal en lesiones y enfermedades de las neuronas motoras pueden ayudar significativamente y acelerar los descubrimientos de la investigación experimental para las pruebas clínicas.

Introducción

Las neuronas motoras frénicas (MN), que se extienden desde los niveles de miotoma C3 hasta C6, forman el enlace final desde el sistema nervioso central (SNC) hasta el músculo del diafragma¹. Las unidades motoras frénicas (UM) están compuestas por una sola MN espinal y sus fibras musculares diafragmáticas inervadas, formando la unidad funcional más pequeña del sistema neuromuscular respiratorio. La función ventilatoria requiere una contracción adecuada del músculo diafragma lograda a través de la activación coordinada de la piscina frénica MU ^2,3. Muchas....

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados y llevados a cabo de acuerdo con las pautas establecidas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Missouri. Los experimentos se realizaron en ratas Sprague-Dawley macho adultas, de 11 a 15 semanas de edad. Estas ratas se alojaron en parejas y se mantuvieron bajo un ciclo de luz-oscuridad de 12:12, con acceso a alimentos peletizados comerciales estándar y agua tratada con HCl disponible en todo momento.

1. Preparación de animales y administración de anestesia

1. Use equipo de protección personal adecuado mi....

Discusión

En las enfermedades degenerativas de la EM, como la ELA, es crucial evaluar las UM implicadas en la ventilación²⁸. A pesar de la ocurrencia de degeneración respiratoria por MN en pacientes con ELA, el inicio específico y la progresión de la muerte por MN siguen siendo incompletamente comprendidos 29,30,31. Reconociendo la importancia de este aspecto, se han empleado v.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL Glass Syringe	Kent Scientific Corporation	SOMNO-2ML
50 mL, Model 705 RN syringe	Hamilton Company	7637-01	Utilized to conduct intrapleural injection
5008 - Formulab Diet	LabDiet	0001325
Autoclavable 26 G needles (26S RN 9.52 mm 40°)	Hamilton Company	7804-04	Utilized to conduct intrapleural injection
Cholera toxin B-subunit (CTB)	MilliporeSigma	C9903	Utilized for intrapleural injection to label surviving motor neurons
Cholera toxin B-subunit conjugated to saporin (CTB-SAP)	Advanced Targeting Systems	IT-14	Utilized for intrapleural injection to cause motor neuron death
Detachable Cable	Technomed	202845-0000	to connect the recorder electrode to the electrodiagnostic machine
Disposable 2" x 2" disc electrode with leads	Cadwell	302290-000	ground electrode
disposable monopolar needles 28 G	Technomed	202270-000	cathode and anode stimulating electrodes- recording electrodes
EMG needle cable (Amp/stim switch box)	Cadwell	190266-200	to connect monopolar electrodes to electrodiagnostic stimulator
Helping Hands alligator clip with iron base	Radio Shack	64-079	Maintaining recording electrode placement
Isoflurane (250 mL bottle)	Piramal Healthcare
monoject curved tip irrigating syringe	Covidien	81412012	utilized for application of electrode gel
PhysioSuite Physiological Monitoring System with RightTemp Homeothermic Warming	Kent Scientific Corporation	PS-RT	Includes infrared warming pad, rectal probe, and pad temperature probe
Pro trimmer Pet Grooming Kit	Oster	078577-010-003	clippers for hair removal
Saporin (SAP)	Advanced Targeting Systems	PR-01	Utilized for intrapleural injection (control agent when injected by itself)
Sierra Summit EMG system	Cadwell Industries, Inc., Kennewick, WA		portable electrodiagnostic system
SomnoSuite Low-Flow Digital Anesthesia System	Kent Scientific Corporation	SOMNO	Includes anti-spill, anti-vapor bottle top adapter; Y adapter tubing; charcoal scavenging filter
Sprague-Dawley rat	Envigo colony 208a, Indianapolis, IN
Veterinarian petroleum-based ophthalmic ointment	Puralube	26870	applied during anesthesia to avoid corneal injury