13Marcaje deC-6-glucosa asociado con LC-MS: identificación de órganos primarios de plantas en la síntesis de metabolitos secundarios

Resumen

El método desarrollado de marcaje con ¹³C_6-glucosa combinado con espectrometría de masas de alta resolución por cromatografía líquida es versátil y sienta las bases para futuros estudios sobre los órganos primarios y las vías implicadas en la síntesis de metabolitos secundarios en plantas medicinales, así como la utilización integral de estos metabolitos secundarios.

Resumen

En este trabajo se presenta un método novedoso y eficiente para certificar órganos primarios implicados en la síntesis de metabolitos secundarios. Como el metabolito secundario más importante en Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Mano. -Mzt. (PPY), la saponina de París (PS) tiene una variedad de actividades farmacológicas y la PPY tiene una demanda creciente. Este estudio estableció cuatro tratamientos de alimentación y no alimentación con hoja, rizoma y tallo vascular ¹³C_6-Glucosa para certificar con precisión los órganos primarios involucrados en la síntesis de saponinas de París VII (PS VII). Mediante la combinación de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), se calcularon de forma rápida y precisa las proporciones ¹³C/¹²C de hoja, rizoma, tallo y raíz en diferentes tratamientos, y se encontraron cuatro tipos de proporciones de picos de iones isotópicos (M^-) de PS: (M+1) ⁻/M⁻, (M+2) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻ y (M+4) ⁻/M⁻. Los resultados mostraron que la relación de ¹³C/¹²C en los rizomas de los tratamientos de alimentación con tallo-haz vascular y rizoma fue significativamente mayor que en el tratamiento sin alimentación. En comparación con el tratamiento sin alimentación, la proporción de moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ en las hojas aumentó significativamente bajo los tratamientos de alimentación con hojas y haces vasculares del tallo. Simultáneamente, en comparación con el tratamiento sin alimentación, la proporción de moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ en las hojas bajo tratamiento con rizoma no mostró diferencias significativas. Además, la proporción de moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ en el tallo, la raíz y el rizoma no mostró diferencias entre los cuatro tratamientos. En comparación con el tratamiento sin alimentación, la proporción de la molécula de saponina Paris II (PS II) (M+2) ⁻/M⁻ en las hojas bajo el tratamiento de alimentación foliar no mostró diferencias significativas, y la relación (M+3) ⁻/M⁻ de las moléculas de PS II en las hojas bajo el tratamiento de alimentación foliar fue menor. Los datos confirmaron que el órgano principal para la síntesis de PS VII son las hojas. Sienta las bases para la futura identificación de los órganos primarios y las vías implicadas en la síntesis de metabolitos secundarios en las plantas medicinales.

Introducción

Las vías biosintéticas de los metabolitos secundarios en las plantas son intrincadas y diversas, e involucran órganos de acumulación altamente específicos y diversos¹. En la actualidad, los sitios específicos de síntesis y los órganos responsables de los metabolitos secundarios en muchas plantas medicinales no están bien definidos. Esta ambigüedad plantea un obstáculo significativo para el avance estratégico y la implementación de métodos de cultivo diseñados para optimizar tanto el rendimiento como la calidad de los materiales medicinales.

La biología molecular, la bioquímica y las técnicas de marcaje de isótopos se emplean ampliamente para desentrañar las vías de síntesis y los sitios de metabolitos secundarios en plantas medicinales 2,3,4,5, y cada una de estas metodologías exhibe fortalezas y limitaciones únicas, como diferencias en eficiencia y precisión. Los enfoques de biología molecular, por ejemplo, ofrecen una alta precisión en la identificación de los sitios dentro de las rutas biosintéticas, pero requieren mucho tiempo. Su utilidad se ve aún más limitada para las especies que carecen de secuencias genómicas disponibles públicamente, lo que hace que estas técnicas sean menos viables para estos casos⁶. Por el contrario, las técnicas de marcaje de isótopos, que emplean proporciones isotópicas como ³C/¹²C, ²H/¹H y ¹⁸O/¹⁶O, proporcionan un medio rápido y accesible para investigar los mecanismos de síntesis, transporte y almacenamiento de metabolitos secundarios ^7,8. Pueden revelar la distribución espacial de compuestos orgánicos e isótopos estables en las hojas, permitiendo así la reconstrucción de las condiciones ambientales experimentadas por las hojas a lo largo de su ciclo de vida⁹. Además, la aplicación de marcadores isotópicos externos, como ¹³C_6-Glucosa ¹⁰ y ¹³C 6-fenilalanina¹¹, permite la generación de metabolitos secundarios marcados con carbono, lo que mejora nuestra comprensión de su producción y función.

Las técnicas tradicionales de marcaje de isótopos de carbono se enfrentan a dificultades a la hora de identificar los órganos específicos responsables de la síntesis de metabolitos secundarios debido a la naturaleza altamente específica de sus vías biosintéticas y mecanismos de transporte. La cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) ha cobrado importancia como instrumento analítico fundamental en este campo, ya que ofrece un método sólido para el seguimiento de isótopos exógenos en la síntesis química de fármacos e investiga procesos in vivo como la absorción, distribución, metabolismo y excreción¹². La sensibilidad, la sencillez y la fiabilidad superiores de la LC-MS la convierten en una opción ideal para monitorizar la producción de metabolitos secundarios en las plantas¹³. En los últimos tiempos, la LC-MS se ha visto cada vez más favorecida por su aplicación en técnicas de etiquetado de isótopos externos, lo que permite evaluar la eficiencia del etiquetado en diferentes muestras. Esta metodología proporciona información crítica sobre los órganos primarios involucrados en la síntesis de metabolitos secundarios en plantas medicinales, sirviendo como un complemento invaluable a los métodos biológicos para identificar los órganos de síntesis de estos compuestos^14,15. En consecuencia, este enfoque no solo facilita la comparación de las eficiencias de etiquetado entre varios especímenes, sino que también arroja luz sobre los órganos clave implicados en la generación de metabolitos secundarios de las plantas, mejorando así nuestra comprensión de su biosíntesis.

Introdujimos un método novedoso que combina el marcaje de isótopos de carbono con la detección de LC-MS para identificar los órganos primarios responsables de sintetizar metabolitos secundarios en plantas medicinales. La saponina de París (PS) tiene una variedad de actividades farmacológicas como el anticancerígeno, la inmunomodulación y la antiinflamatoria¹⁶, y la PPY tiene una demanda cada vez mayor¹⁷. Por lo tanto, utilizamos plántulas PPY como sujetos de investigación y desciframos que las hojas son el órgano principal para sintetizar la saponina Paris VII (PS VII) (Figura 1B) mediante el uso del marcaje ¹³C_6-Glucosa asociado con el método LC-MS. Nuestro enfoque incluyó cuatro tratamientos diferentes que involucraron la alimentación con ¹³C_6-Glucosa a los haces de hojas, rizomas y troncos vasculares, así como un control sin alimentación. La elección de ¹³C_6-Glucosa es estratégica, ya que se metaboliza rápidamente en acetil coenzima A a través de la respiración, lo que facilita la síntesis de PS. Empleando la abundancia natural de ¹³C, utilizamos un sistema de espectrómetro de masas de cromatografía de gases-relación de isótopos estables (GC-IRMS) para evaluar las proporciones de ¹³C/¹²C en varios órganos de la planta y para analizar las proporciones de picos de iones isotópicos en las moléculas PS VII y Paris saponinas II (PS II) (Figura 1B). Nuestra metodología, que aprovecha ¹³precursores de metabolitos secundarios de plantas marcados con C y técnicas de espectrometría de masas de vanguardia, ofrece una alternativa más simple y precisa a los métodos convencionales de etiquetado de isótopos de carbono. Este novedoso enfoque no solo profundiza nuestra comprensión de los órganos implicados en la síntesis de metabolitos secundarios en las plantas medicinales, sino que también sienta una base sólida para futuras exploraciones de las vías biosintéticas de estos compuestos.

Protocolo

1. Preparación experimental

1. Asegúrese de que durante el crecimiento de la planta, la humedad relativa del invernadero sea del 75%, las temperaturas día/noche sean de 20 °C/10 °C, el fotoperiodo se componga de 12 h de día y 12 h de noche, y la intensidad de la luz sea de 100 μmol·^m-2·^s-1. Proporcionan irradiación a través de lámparas de diodos emisores de luz (LED), manteniendo una distancia de 30 cm entre la lámpara LED y el dosel de la planta.
   NOTA: El fotoperiodo y la intensidad de la luz dependen del número de horas de sol durante el periodo de crecimiento en Yunnan. La irradiancia se mide rutinariamente mediante un sensor cuántico (ver Tabla de Materiales). Realizar los cambios necesarios en los parámetros ambientales de acuerdo con las características de la planta medicinal. Una vez que estas condiciones ambientales se han calibrado cuidadosamente en función de las características de la planta y el perfil de luz solar regional, es fundamental mantener la consistencia en estos ajustes durante toda la duración del experimento. Los cambios arbitrarios en los parámetros ambientales después de su establecimiento inicial podrían comprometer la integridad del experimento y la fiabilidad de los resultados.
2. Utilice un enfoque hidropónico¹⁸ para garantizar la precisión y especificidad de nuestro experimento. Asegúrese de que las plántulas PPY lavadas de 2 años (cosechadas en Wenshan, provincia de Yunnan (104°11′E, 23°04′N) se sumerjan en una concentración estándar de ¹/₄ de la solución nutritiva de Hoagland durante 3 días para su adaptación.
   1. Prepare la solución de nutrientes del Hoagland (consulte la Tabla de materiales) de acuerdo con las instrucciones; añadir 1,26 g de polvo de Hoagland y 0,945 g de polvo de nitrato de calcio en 4 L de agua purificada. Prepare la solución ^{de 13}C_6-glucosa (ver Tabla de Materiales) como se describe en el manual estándar; añadir 0,2 g de ^{polvo de 13}C_6-Glucosa en 100 ml de agua purificada o de solución nutritiva de Hoagland.
   2. Prepare el tanque hidropónico y la bomba de oxígeno (Figura 2; ver Tabla de Materiales).
      NOTA: En la configuración hidropónica, la utilización de una solución de ¹³C_6-Glucosa para el etiquetado evita la influencia de los microorganismos del suelo, asegurando así que la solución contribuya directamente a la rápida síntesis de metabolitos secundarios en las plantas medicinales. Para optimizar las condiciones para la absorción de ¹³C_6-Glucosa por parte de las plantas, es imperativo regular el caudal de la bomba de oxígeno entre 4 y 8 L/min. Este caudal controlado es crucial para evitar que las plántulas floten sobre la superficie del agua, lo que podría dificultar significativamente su capacidad para absorber la ¹³C_6-glucosa de manera efectiva. Mantener las plántulas sumergidas a la profundidad correcta permite una absorción eficiente del compuesto de etiquetado, lo que garantiza el éxito del proceso de síntesis de metabolitos en el sistema hidropónico.

2. Operación del experimento de etiquetado de carbono

1. Establecer cuatro tratamientos y trazar los órganos de síntesis y las vías de PS VII y PS II en PPY para demostrar que las hojas son el órgano principal para sintetizar PS.
   1. En el Tratamiento 1, la plántula PPY no se alimenta; en el Tratamiento 2, rocíe las hojas de plántula PPY con 0.2% ¹³C_6-Glucosa; en el Tratamiento 3, alimente los rizomas de las plántulas PPY con 0.2% ¹³C_6-glucosa; en el Tratamiento 3, alimente la plántula PPY en la incisión del tallo con ¹³C_6-glucosa al 0,2% (Figura 2A).
      NOTA: El tratamiento 1 se establece como un grupo de control. El tratamiento 2 está configurado para demostrar que las hojas pueden sintetizar el PS. Los tratamientos 3 y 4 están configurados para demostrar que los rizomas pueden absorber ¹³C_6-glucosa.
   2. En los tratamientos 1 y 2, cultive las plántulas PPY en una solución nutritiva normal de Hoagland. Rocíe 5 mL de solución de 0,2% ¹³C_6-Glucosa una vez por la mañana, por la tarde y por la noche sobre las hojas del Tratamiento 2.
   3. En los tratamientos 3 y 4, cultive las plántulas PPY en la solución nutritiva de Hoagland que contiene ^{0,2% de 13}C_6-glucosa. En el Tratamiento 4, use un bisturí (ver Tabla de Materiales) para cortar los tallos de las plántulas PPY desde el medio, pero mantenga los haces vasculares unidos.
   4. Deje que cada tratamiento esté etiquetado durante 3 días y cambie la solución nutritiva cada 1,5 días. Realice el experimento utilizando un diseño de bloques aleatorios y repita cada tratamiento 3 veces.
      NOTA: Al rociar las hojas, es importante colocar un papel absorbente detrás de las hojas rociadas. Esto evita que las gotas de agua caigan en la solución de nutrientes que se encuentra debajo, lo que de otro modo podría afectar los resultados del experimento. Los cortes en los tallos no se eliminan todos, sino que tienen conductos adjuntos que son visibles a simple vista.

3. Métodos de muestreo y preparación

1. Recoja hojas, tallos, rizomas y raíces de cada tratamiento por separado al final del experimento de 3 días con ¹³C_6-Glucosa. Lave bien los órganos de la planta recolectados para eliminar las impurezas de la superficie.
   NOTA: La ausencia de ^{abundancia de 13}C se puede encontrar mediante el análisis LC-MS de la solución de lavado, lo que demuestra que el lavado está limpio¹⁹.
2. Utilice un horno eléctrico de secado rápido a temperatura constante (consulte la Tabla de materiales) para secar los órganos de la planta lavados. Comience a 105 °C durante 30 minutos y luego ajuste a 60 °C hasta que el peso esté constante. Triture los órganos de la planta seca hasta convertirlos en polvo utilizando un molinillo rápido de muestras totalmente automático (consulte la tabla de materiales).
   NOTA: El polvo se utiliza para el análisis cuantitativo de las proporciones PS VII, II y ¹³C/¹²C en diferentes órganos de la planta.
3. Utilice una balanza analítica electrónica (consulte la Tabla de materiales) para pesar con precisión 30 mg de polvo para cada muestra y colóquela en 2 ml de etanol-agua al 75% v/v. Utilice un limpiador ultrasónico CNC (consulte la tabla de materiales) y realice la extracción ultrasónica a 25 °C durante 20 min (60 kHz), repita 2 veces; Fusionar las soluciones de extracción y preparar tres muestras paralelas²⁰.
   NOTA: Los errores en el peso de la muestra deben minimizarse.
4. Utilice nitrógeno para secar la solución de extracción, luego disuélvala en metanol cromatográfico hasta un volumen de 1 mL. Antes de la inyección, utilice un filtro de fase orgánica de 0,22 μm (consulte la tabla de materiales) para la filtración (figura 2B).
   NOTA: No sople el extracto cuando se seque con nitrógeno gaseoso; El extracto debe pasar a través de una membrana microporosa para garantizar que las impurezas interfieran mínimamente.

4. Configuración y funcionamiento de LC-MS

1. Configuración de MS
   1. Active la bomba de vacío colocando su interruptor en la posición de encendido. Abra la válvula principal del cilindro de gas argón y, a continuación, ajuste la válvula de presión parcial para alcanzar una presión objetivo de aproximadamente 0,3 MPa. Después de esto, asegúrese de que la válvula de gas nitrógeno también esté abierta.
   2. Inicie el software de control MS (consulte la tabla de materiales). Haga clic en la fuente de ionización de electrospray calentada (HESI Source) en el panel de software e ingrese los parámetros, incluido el voltaje capilar (3.0 kV para modo negativo), la temperatura capilar (350 °C), el caudal de gas de vaina (N₂) (35 unidades arbitrarias), el caudal de gas auxiliar (N₂) (15 unidades arbitrarias)), a través de un barrido completo basado en la masa molecular de PS (operado de m/z 100-1.500). Haga clic en el botón Aplicar para activar la fuente de iones.
      NOTA: Espere al menos 8 h para asegurar un grado de vacío suficiente para las condiciones experimentales. Verifique que la presión del gas argón y nitrógeno sea lo suficientemente alta antes del análisis.
2. Ejecución previa de LC
   1. Prepare la fase móvil A mezclando ácido fórmico al 0,1% con agua y use acetonitrilo para la fase móvil B (ver Tabla de Materiales). Desgasificar ambas fases en un sonicador de baño de ultrasonidos durante 15 minutos para eliminar los gases disueltos. A continuación, conecte la fase móvil A a su respectivo paso de fluido y haga lo mismo con la fase móvil B. Por último, mezcle una solución de metanol-agua 1:9 v/v para el líquido de limpieza y llene manualmente los frascos de la bomba y el inyector.
      NOTA: La frecuencia del sonicador de baño de ultrasonidos es de 40 kHz.
3. Establecimiento del método LC
   1. Seleccione el botón "Configuración del instrumento" para acceder a la ventana de edición de métodos.
   2. Presione el botón "Nuevo" para iniciar la creación de un nuevo método de instrumento LC-MS.
   3. Establezca el tiempo de ejecución total para el método LC. A continuación, introduzca los valores necesarios para el límite de presión, el caudal total, el gradiente de flujo, la temperatura de la muestra, la temperatura de la columna y el delta de la temperatura de preparación dentro de la ventana de edición de métodos.
      NOTA: Los ajustes del método del instrumento LC-MS se adaptan al analito de interés y al tipo de columna de cromatografía líquida utilizada. Para obtener resultados óptimos, utilice un caudal de 0,3 mL/min con una columna BEH C18 mantenida a 40 °C (consulte la tabla de materiales). La elución en gradiente se configura de la siguiente manera: comience en 10% B, aumentando linealmente a 30% B durante 8 min, luego a 45% B de 8 a 16 min, a 50% B de 16 a 24 min y a 70% B de 24 a 30 min. Inmediatamente después de esto, revierta el gradiente a la condición inicial del 10% B en 0,1 min, manteniéndolo allí durante 2,9 min adicionales. Inyecte un volumen de muestra de 5 μL para cada análisis. Los ajustes del método del instrumento LC-MS dependen de la sustancia específica que se va a analizar y del tipo de columna de cromatografía líquida utilizada²¹.
4. Adquisición de MS
   1. En la pestaña Configuración , elija el tipo de experimento MS general o MSⁿ para la configuración del método MS. Ingrese los valores necesarios para configurar el tiempo de adquisición, la polaridad (positiva o negativa), el rango de masa, el número de válvulas de desvío y la duración de la válvula de desvío. Después de ingresar estos detalles, haga clic en el botón "Guardar" para finalizar y guardar estos ajustes como un método de instrumento.
      NOTA: Los ajustes predeterminados sin columna de cromatografía son los siguientes: tiempo de adquisición, 2 min; polaridad, positiva o negativa; Rango de masa, de 100 a 1.500.
5. Realizar espectrometría de masas de múltiples etapas de acuerdo con los métodos convencionales.
   1. Emplee siempre el modo de adquisición dependiente de datos (DDA) para la recopilación de datos en espectrometría de masas de varias etapas. En el modo DDA, el espectrómetro de masas identifica los cinco iones más intensos durante cada escaneo en la primera etapa de la MS en tándem, que posteriormente se fragmentan y se examinan en la segunda etapa de la espectrometría de masas en tándem.
      NOTA: Los datos recopilados de MS y MS/MS se pueden utilizar para el análisis posterior y la búsqueda en bases de datos.

5. Adquisición, análisis y cálculo manual de datos

1. Adquisición y análisis de datos
   1. Haga doble clic en los archivos sin procesar para abrir todos los espectros de masas de MS. Calcule manualmente los valores de diferencia m/z entre el ion y los iones de fragmento correspondientes.
   2. Importe los archivos de datos sin procesar de los tratamientos de control y muestras y los blancos en el software de análisis de espectrometría de masas para identificar los PS calculando con precisión la masa y los fragmentos de PS.
      NOTA: PS VII y PS II se identifican por comparación con los tiempos de retención y la coelución de soluciones estándar auténticas. LC-MS detecta una serie de pequeños picos en las posiciones de los picos de iones moleculares. La relación de cada serie de picos de iones isotópicos es constante. Cuando se dan isótopos exógenos ^{de 13}C, la abundancia total de ¹³C en la planta aumenta y las proporciones de la serie de picos de iones isótopos de los metabolitos secundarios de la planta cambian. La tolerancia máxima de error de masa se establece en 5 ppm.
   3. Escanee el rango de masa m/z 500-1.500 para identificar el pico básico. Determine el peso molecular preciso con 4 decimales, de acuerdo con el peso molecular preciso y el tiempo de retención de la molécula objetivo. Busque el área máxima del flujo de iones isótopos en serie y derive los valores de M^-, (M+1) ^-, (M+ ^2)-, (M+ ^3)-, (M+4) ^-. Cuando la fase móvil contiene ácido fórmico, los iones negativos también incluyen (M + COOH) ⁻, (M + COOH + 1) ⁻, (M + COOH + 2) ⁻, (M + COOH + 3) ⁻ y (M + COOH + 4) ⁻.
      NOTA: La selección de picos dentro del rango de masa m/z 500-1.500 mejora la precisión de la identificación de picos de iones moleculares para PS VII y PS II. Por ejemplo, el espectro de masa de iones negativos de PS VII (C₅₁H₈₂O₂₁, 1030.5349) se ioniza principalmente con iones ^COOH− en una mezcla de ácido fórmico y agua. Los iones isótopos en serie observados incluyen 1029.53⁻, 1030.54⁻, 1031.54⁻, 1032.55⁻, 1033.55⁻, y se extienden hasta 1079.56−.
2. Cálculo de datos
   1. Para reducir el efecto de la abundancia natural de ¹³C, calcule las proporciones de corrientes iónicas marcadas y no marcadas para cada órgano bajo diferentes tratamientos, centrándose específicamente en las relaciones (M+1)^-/ M^-, (M+2)^-/M^-, (M+3)^-/ ^M-y (M+4)^-/ M^-. Para diferenciar entre isótopos marcados y naturales para una evaluación precisa de la incorporación de ¹³C, calcule estas proporciones para n = 1, 2, 3, 4 utilizando la ecuación (1).
      Relación = A (M+2) ⁻/ ^AM− (1)
      PD: (M+2) ⁻ incluye (M+2+COOH) ⁻ y (M+2) ⁻; M⁻ incluyen (M+COOH) ^- y M⁻.
      NOTA: Aquí, M^- se refiere a las áreas máximas combinadas de las corrientes iónicas para (M + COOH) ⁻ y M ⁻, principalmente ionizadas con COOH⁻ en ácido fórmico-agua. A representa el área del pico. Por ejemplo, las fórmulas para calcular las proporciones PS VII se ilustran de la siguiente manera:
      Relación+1= (A1030.54+A1076.55)/(A1029.53+A1075.55)
      Relación+2= (A1031.54+A1077.55)/(A1029.53+A1075.55)
      Relación+3= (A1032.55+A1078.56)/(A1029.53+A1075.55)
      Relación+4= (A1033.55+A1079.56)/(A1029.53+A1075.55)

Resultados

Para confirmar que el_{suministro de} ¹³C6-glucosa en los rizomas fue exitoso, analizamos más a fondo las proporciones de isótopos ^{de 13}C/¹²C en los rizomas. Las proporciones de isótopos ¹³C/¹²C de los tratamientos 3 y 4 fueron mucho más altas que las del tratamiento 2 (Figura 1A). Los resultados indicaron que ^{la 13}_C6-Glucosa del Tratamiento 3 y 4 ingresó a los rizomas a través de la ingestión.

Discusión

La implementación exitosa de este protocolo depende de una investigación exhaustiva sobre las propiedades fisiológicas, los tejidos, los órganos y los metabolitos secundarios de las plantas. El enfoque de diseño experimental descrito en el protocolo establece una base sólida para investigar las vías biosintéticas de los metabolitos secundarios de las plantas. Los factores críticos en este experimento son (1) determinar la edad de las plántulas perennes y (2) elegir el momento correcto de detección de marcadore...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 % Formic acid water	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
13C6-Glucose powder	MERCK	110187-42-3
Acetonitrile	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
AUTOSAMPLER VIALS	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 column	Waters,Milfor,MA	1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Electric constant temperature blast drying oven		DHG-9146A
Electronic analytical balance	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Ethanol	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44955
Fully automatic sample rapid grinder	Shanghai Jingxin Technology	Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Hoagland solution	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Hydroponic tank	JRD	1020421
Isodat software	Thermo Fisher Scientific	3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Nitrogen manufacturing instrument	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Organic phase filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Oxygen pump	Magic Dragon	MFL
Quantum sensor	Highpoint	UPRtek
Scalpel	Handskit	11-23
Sprinkling can	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2