13Marcaje deC-6-glucosa asociado con LC-MS: identificación de órganos primarios de plantas en la síntesis de metabolitos secundarios

Resumen

El método desarrollado de marcaje con ¹³C_6-glucosa combinado con espectrometría de masas de alta resolución por cromatografía líquida es versátil y sienta las bases para futuros estudios sobre los órganos primarios y las vías implicadas en la síntesis de metabolitos secundarios en plantas medicinales, así como la utilización integral de estos metabolitos secundarios.

Resumen

En este trabajo se presenta un método novedoso y eficiente para certificar órganos primarios implicados en la síntesis de metabolitos secundarios. Como el metabolito secundario más importante en Parispolyphylla var. yunnanensis (Franch.) Mano. -Mzt. (PPY), la saponina de París (PS) tiene una variedad de actividades farmacológicas y la PPY tiene una demanda creciente. Este estudio estableció cuatro tratamientos de alimentación y no alimentación con hoja, rizoma y tallo vascular ¹³C_6-Glucosa para certificar con precisión los órganos primarios involucrados en la síntesis de saponinas de París VII (PS VII). Mediante la combinación de cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS), se calcularon de forma rápida y precisa las proporciones ¹³C/¹²C de hoja, rizoma, tallo y raíz en diferentes tratamientos, y se encontraron cuatro tipos de proporciones de picos de iones isotópicos (M^-) de PS: (M+1) ⁻/M⁻, (M+2) ⁻/M⁻, (M+3) ⁻/M⁻ y (M+4) ⁻/M⁻. Los resultados mostraron que la relación de ¹³C/¹²C en los rizomas de los tratamientos de alimentación con tallo-haz vascular y rizoma fue significativamente mayor que en el tratamiento sin alimentación. En comparación con el tratamiento sin alimentación, la proporción de moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ en las hojas aumentó significativamente bajo los tratamientos de alimentación con hojas y haces vasculares del tallo. Simultáneamente, en comparación con el tratamiento sin alimentación, la proporción de moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ en las hojas bajo tratamiento con rizoma no mostró diferencias significativas. Además, la proporción de moléculas de PS VII (M+2) ⁻/M⁻ en el tallo, la raíz y el rizoma no mostró diferencias entre los cuatro tratamientos. En comparación con el tratamiento sin alimentación, la proporción de la molécula de saponina Paris II (PS II) (M+2) ⁻/M⁻ en las hojas bajo el tratamiento de alimentación foliar no mostró diferencias significativas, y la relación (M+3) ⁻/M⁻ de las moléculas de PS II en las hojas bajo el tratamiento de alimentación foliar fue menor. Los datos confirmaron que el órgano principal para la síntesis de PS VII son las hojas. Sienta las bases para la futura identificación de los órganos primarios y las vías implicadas en la síntesis de metabolitos secundarios en las plantas medicinales.

Introducción

Las vías biosintéticas de los metabolitos secundarios en las plantas son intrincadas y diversas, e involucran órganos de acumulación altamente específicos y diversos¹. En la actualidad, los sitios específicos de síntesis y los órganos responsables de los metabolitos secundarios en muchas plantas medicinales no están bien definidos. Esta ambigüedad plantea un obstáculo significativo para el avance estratégico y la implementación de métodos de cultivo diseñados para optimizar tanto el rendimiento como la calidad de los materiales medicinales.

La biología molecular, la bioquímica y las técnicas de marcaje de isótopos se....

Protocolo

1. Preparación experimental

1. Asegúrese de que durante el crecimiento de la planta, la humedad relativa del invernadero sea del 75%, las temperaturas día/noche sean de 20 °C/10 °C, el fotoperiodo se componga de 12 h de día y 12 h de noche, y la intensidad de la luz sea de 100 μmol·^m-2·^s-1. Proporcionan irradiación a través de lámparas de diodos emisores de luz (LED), manteniendo una distancia de 30 cm entre la lámpara LED y el dosel de la planta.
   NOTA: El fotoperiodo y la intensidad de la luz dependen del número de horas de sol durante el periodo de crecimiento en Yunnan. La irradiancia se mide rutinariamente mediante ....

Discusión

La implementación exitosa de este protocolo depende de una investigación exhaustiva sobre las propiedades fisiológicas, los tejidos, los órganos y los metabolitos secundarios de las plantas. El enfoque de diseño experimental descrito en el protocolo establece una base sólida para investigar las vías biosintéticas de los metabolitos secundarios de las plantas. Los factores críticos en este experimento son (1) determinar la edad de las plántulas perennes y (2) elegir el momento correcto de detección de marcadore.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 % Formic acid water	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
13C6-Glucose powder	MERCK	110187-42-3
Acetonitrile	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44890
AUTOSAMPLER VIALS	Biosharp Biotechnology Company	44866
BEH C18 column	Waters,Milfor,MA	1.7μm,2.1*100 mm
CNC ultrasonic cleaner	Kunshan Ultrasound Instrument Co., Ltd	KQ-600DE
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific, Fremont,CA	3
Compound DiscovererTM  software	Thermo Scientific,Fremont,CA	3
Electric constant temperature blast drying oven		DHG-9146A
Electronic analytical balance	Sedolis Scientific Instruments Beijing Co., Ltd	SOP
Ethanol	Chengdu Kelong Chemical Reagent Factory	44955
Fully automatic sample rapid grinder	Shanghai Jingxin Technology	Tissuelyser-48
Gas Chromatography-Stable Isotope Ratio Mass Spectrometer	Thermo Fisher	Delta V Advantage
Hoagland solution	Sigma-Aldrich	H2295-1L
Hydroponic tank	JRD	1020421
Isodat software	Thermo Fisher Scientific	3
Liquid chromatography high-resolution mass spectrometry	Agilent Technology	Agilent 1260 -6120
Nitrogen manufacturing instrument	PEAK SCIENTIFIC	Genius SQ 24
Organic phase filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	44890
Oxygen pump	Magic Dragon	MFL
Quantum sensor	Highpoint	UPRtek
Scalpel	Handskit	11-23
Sprinkling can	CHUSHI	WJ-001
Xcalibur  software	Thermo Fisher Scientific	4.2