Aislamiento de médula ósea de ratón neonatal y preparación de macrófagos derivados de la médula ósea

Resumen

Este protocolo describe un método sencillo y no enzimático para aislar células de médula ósea de ratón neonatal de 7-9 días de edad y generar macrófagos diferenciados utilizando un sobrenadante de células L929 como fuente de factor estimulante de colonias de granulocitos (M-CSF). Los macrófagos derivados de la médula ósea se analizaron más a fondo para determinar los antígenos de superficie F4/80, CD206, CD11b y la competencia funcional.

Resumen

Varias técnicas para aislar la médula ósea de ratones adultos han sido bien establecidas. Sin embargo, aislar la médula ósea de ratones neonatos es un desafío y requiere mucho tiempo, pero para algunos modelos, es traslacionalmente relevante y necesario. Este protocolo describe un método eficiente y sencillo para preparar células de médula ósea de cachorros de 7 a 9 días de edad. Estas células se pueden aislar o diferenciar aún más en tipos específicos de células de interés. Los macrófagos son células inmunitarias cruciales que desempeñan un papel importante en la inflamación y la infección. Durante el desarrollo, los macrófagos neonatales contribuyen significativamente a la remodelación de los tejidos. Además, el fenotipo y las funciones de los macrófagos neonatales difieren de los de sus homólogos adultos. Este protocolo también describe la diferenciación de los macrófagos neonatales de las células aisladas de la médula ósea en presencia de medio condicionado con L929. Los marcadores de superficie para macrófagos neonatales diferenciados se evaluaron mediante análisis de citometría de flujo. Para demostrar la funcionalidad, también se probó la eficiencia fagocítica utilizando Escherichia coli conjugada con colorante sensible al pH.

Introducción

La médula ósea encierra poblaciones de células madre hematopoyéticas y mesenquimales que son autorrenovables y se pueden diferenciar en varios linajes celulares. Las células madre hematopoyéticas de la médula ósea dan lugar a linajes mieloides y linfoides¹. Las células madre mesenquimales producen osteoblastos (hueso), adipocitos (grasa) o condrocitos (cartílago)². Estas células tienen múltiples aplicaciones en el campo de la biología celular y la ingeniería de tejidos, incluida la terapia génica ^3,4. Las células progenitoras presentes en la....

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales de Virginia Occidental y se realizaron siguiendo las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Nacional de Investigación. Para este estudio se utilizaron crías de ratón C57BL/6J. Los detalles de todos los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de los medios

1. Prepare 3 mL de medio de cultivo MEM suplementado con 10% de FBS, 2 mM de glutamina, 25 mM de HEPES y penicilina (100 U/mL)/estreptomicina (100 μg/mL) ....

Discusión

La investigación con modelos de ratones neonatos puede presentar una serie de desafíos. Los neonatos tienen un sistema inmunológico en desarrollo que es único en comparación con los adultos⁸. Como tal, no se debe asumir que los datos generados a partir de modelos animales adultos se aplican a los recién nacidos, y varios trabajos publicados han articulado bien esta idea^18,19. Por lo tanto, se necesitan modelos neonatales específicos.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm strainer	Greiner	542040	Cell culture
96 well round (U) bottom plate	Thermo Scientific	12-565-65	Cell culture
Anti-mouse CD11b-BV786	BD Biosciences	740861	FACS analysis
Anti-mouse CD206-Alexa Fluor488	BD Biosciences	141709	FACS analysis
Anti-mouse F4/80-PE	BD Biosciences	565410	FACS analysis
Countess3	Thermo Scientific	TSI-C3ACC	Automated cell counter
DMEM	Hyclone	SH30022.01	Cell culture
DMSO	VWR	WN182	Cell culture
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV	Cell culture
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775	Infection
EVOS FL	Invitrogen	12-563-649	Cell Imaging System
FBS	Avantor	76419-584	Cell culture
FluoroBright BMDM	Thermo fisher Scientific	A1896701	Dye free culture media
Glutamine	Cytiva	SH30034.01	Cell culture
HEPES	Cytiva	SH30237.01	Cell culture
L-929	ATCC		Differentiation
LSRFortessa	Becton Dickinson		Flowcytometer
Lysotracker red DND 99	Invitrogen	L7528	Fluorescent dye
MEM	Corning	15-010-CV	Cell culture
Penicillin /streptomycin	Hyclone	SV30010	Cell culture
pHrodo green STP ester	Invitrogen	P35369	Fluorescent dye
T75 flask	Cell star	658170	Cell culture
Trypsin-EDTA	Gibco	25300120	Cell culture
Zeiss 710	Zeiss	P20GM103434	Confocal