Técnica de cultivo in vitro para el estudio de la dinámica celular en escamas de pez cebra

Resumen

Este protocolo ofrece un método para estudiar la dinámica celular utilizando una sencilla técnica de cultivo in vitro . Proporciona una oportunidad para que los investigadores y educadores del pez cebra estudien los procesos celulares, como los relacionados con la homeostasis ósea y la biología celular básica, mediante la visualización de núcleos fluorescentes y células apoptóticas dentro de las escamas.

Resumen

Las escamas de pez cebra ofrecen una variedad de ventajas para su uso en laboratorios estándar con fines de enseñanza e investigación. Las escamas se recogen fácilmente sin necesidad de eutanasia, se regeneran en un par de semanas y son translúcidas y pequeñas, lo que permite observarlas con un microscopio estándar. Las escamas de pez cebra son especialmente útiles en entornos educativos, ya que brindan una oportunidad única para que los estudiantes participen en experiencias de aprendizaje práctico, particularmente en la comprensión de la dinámica celular y los métodos de cultivo in vitro . El objetivo principal de este protocolo es describir un método para recolectar y mantener escamas de pez cebra en cultivo para su uso en una variedad de estudios biológicos utilizando equipos básicos de laboratorio. Además, el protocolo detalla su uso en la comprensión de la homeostasis ósea mediante el examen de la actividad de las células óseas involucradas en la resorción y deposición ósea. También incluye protocolos adicionales para técnicas generales, como la visualización de núcleos y células apoptóticas. El protocolo de cultivo in vitro produce resultados fiables con un mínimo de reactivos y equipos. Este artículo analiza los beneficios del uso de cultivos in vitro de escamas de pez cebra para fomentar la investigación científica y describe los recursos necesarios para apoyar su integración en entornos educativos.

Introducción

En los últimos años, el pez cebra (Danio rerio) se ha convertido en un valioso organismo modelo en diversos campos científicos, como la genética, la biología del desarrollo y la toxicología ^1,2,3. El pez cebra es un pequeño pez tropical de agua dulce nativo de los ríos del sudeste asiático⁴. Se han convertido en un organismo modelo popular en biología debido a su fácil mantenimiento, pequeño tamaño, ciclo reproductivo rápido y embriones translúcidos^. Esto permite una fácil observación d....

Protocolo

Todos los protocolos descritos aquí siguen las pautas del Consejo Canadiense de Cuidado Animal y fueron aprobados anualmente por el comité de Cuidado Animal de la Universidad de Saint Mary's / Mount Saint Vincent University bajo los números de protocolo 20-14 y 21-12. Antes de llevar a cabo este protocolo, los usuarios deben asegurarse de que se sigan las directrices federales y provinciales sobre el uso de animales en la investigación o la enseñanza²³. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. ....

Discusión

Las escamas de pez cebra son un modelo in vitro de fácil acceso para estudiar una variedad de procesos biológicos diferentes que se pueden mantener hasta 2 días utilizando un método de cultivo y una incubadora para simular su entorno natural¹¹. Las básculas tienen una distribución regular y proporcional de las células presentes, lo que permite a los investigadores ver, contar y etiquetar las células y realizar experimentos sencillos de biología c.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	For pH stabilization and prepration of PRS
Concave slide	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)	Sigma	D9805	For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder	Sigma	D5523	For scale culture media
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma	E10521	For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum	Sigma	F4135	For scale culture media
Fluorescence microscope	n/a	n/a
Glacial acetic acid	Fisher	A38 212	For acetate buffer
Glycerol	VWR	BDH1172-4LP	For 80% glycerol - storage scales
HEPES	ThermoFisher	15630106	For scale culture media
Hot plate	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	For preparation of PBS
Lysotracker	ThermoFisher	L7528	For lysosomes  visualization
Maleic acid	Sigma	M0375	For Tris-Maleate buffer
Micropipette	n/a	n/a
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	For preparation of PBS
NaCl	Sigma	S9888	For preparation of PBS
NaNO2	Sigma	S-2252	For 4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	For preparation of 4% PFA
NaOH	Sigma	S5881	For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride	Sigma	P3750	For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/ml	ThermoFisher	15140122	For scale culture media
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	For scale fixation
Sodium acetate	Sigma	S2889	For acetate buffer
Standard compound microscope	n/a	n/a
Stir plate	n/a	n/a
Tartaric acid	Sigma	T6521	For Tartrate buffer
Tris base	Roche	03 118 142 001	For Tris-Maleate buffer