Un modelo de pouchitis en ratas después de proctocolectomía y anastomosis anal con bolsa ileal y anastomosis con sulfato de dextrano sódico

Resumen

Este protocolo describe el método para establecer un modelo de pouchitis en ratas. El modelo de bolsa ileal se creó mediante la realización de una cirugía de anastomosis ileal-anal (IPAA) mediante técnicas microquirúrgicas. Después de la cirugía, la rata fue tratada con sulfato de dextrano sódico (DSS) al 4% durante 4 días.

Resumen

La colitis ulcerosa (CU) es una enfermedad crónica inmunomediada que afecta a todo el colon y el recto con un curso recurrente y remitente, causando morbilidad de por vida. Cuando el tratamiento médico es ineficaz, especialmente en casos de hemorragia gastrointestinal masiva, perforación, megacolon tóxico o carcinogénesis, la cirugía se convierte en la última línea de defensa para curar la colitis ulcerosa. La resección colorrectal total y la anastomosis anal con bolsa ileal (IPAA) ofrecen la mejor oportunidad para el tratamiento a largo plazo. La pouchitis es la complicación postoperatoria más común y problemática. En esta investigación, se emplea la microcirugía para crear un modelo de bolsa ileal en ratas experimentales mediante cirugía IPAA. Posteriormente, se establece un modelo sostenido de pouchitis en ratas mediante la inducción de la inflamación de la bolsa ileal con sulfato de dextrano sódico (DSS). El establecimiento exitoso de la pouchitis en ratas se valida mediante el análisis del estado general postoperatorio, el peso, la ingesta de alimentos y agua, los datos fecales, así como la patología del tejido de la bolsa, la inmunohistoquímica y el análisis de factores inflamatorios. Este modelo animal experimental de pouchitis proporciona una base para estudiar la patogénesis y el tratamiento de la afección.

Introducción

La pouchitis es una inflamación inespecífica que afecta a la bolsa ileal y es una complicación prevalente tras proctocolectomía total y anastomosis anal con bolsa ileal (IPAA) en individuos con colitis ulcerosa (CU)^1,2,3. Esta afección tiene una tasa de incidencia relativamente alta de hasta el 50% y puede causar diversas manifestaciones clínicas, como diarrea, dolor abdominal, pérdida de sangre fecal y fiebre. La causa exacta de la pouchitis sigue siendo difícil de alcanzar, aunque algunos investigadores creen que un cambio en la flora de la pouchitis puede desencadenar la activación inmunitaria y la posterior inflamación 4,5,6,7.

Debido a los desafíos asociados con la realización de ensayos clínicos sobre la pouchitis, los modelos animales pueden servir como herramientas valiosas para estudiar los medicamentos y mecanismos de la pouchitis. Existe una creciente preocupación con respecto a la creación de bolsas ileales de rata, con informes que indican una posible inflamación⁸. Sin embargo, la investigación en este campo sigue siendo escasa debido a la naturaleza compleja del proceso de fabricación, que carece de directrices claras ^9,10. En 1998, Lichtman fue el primero en establecer un modelo de bolsa ileal en ratas Lewis y ratas Sprague-Dawley (SD) mediante la realización de una colectomía total¹¹. Observaron la infiltración de macrófagos, la ulceración de la mucosa y un aumento de la flora bacteriana anaeróbica dentro de los intestinos de estas ratas, lo que proporciona una base sólida para futuras investigaciones sobre la inflamación de la bolsa ileal. Este modelo experimental de pouchitis de rata imita de cerca los signos físicos y los mecanismos subyacentes observados en la pouchitis humana.

Los modelos de colitis ulcerosa preclínica comúnmente aplicados incluyen los modelos DSS y TNBS. El químico inductor ácido 2,4,6-trinitrobenceno sulfónico (TNBS) suele simular la enfermedad de Crohn¹². El modelo DSS, respetado por su eficacia, perfil de seguridad y asequibilidad, se utiliza a menudo como una herramienta fiable para la inducción de la CU debido a los síntomas evidentes observados. Dada la colonización del tejido de la bolsa, inducimos con éxito un modelo de pouchitis utilizando DSS^13,14.

En el presente estudio, se utilizó la microcirugía para crear con éxito un modelo de bolsa ileal en ratas experimentales mediante cirugía IPAA. Posteriormente, se estableció un modelo de pouchitis sostenida en rata mediante la inducción de inflamación de la bolsa ileal con DSS. La precisión durante la cirugía es esencial para la formación exitosa del modelo, y el cuidado postoperatorio también es crucial. Este modelo se puede utilizar para investigar la patogénesis de la pouchitis, evaluar posibles agentes terapéuticos y mejorar nuestra comprensión de esta compleja afección. El estudio simplifica el procedimiento de fabricación de la bolsa ileal, reduciendo la duración de la operación y aumentando la eficiencia, estableciendo así una base sólida para la investigación fundamental sobre los trastornos de la bolsa posquirúrgica.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las políticas de los comités de ética del Hospital General de la Universidad Médica de Tianjin. Para este estudio se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley de entre 9 y 12 semanas de edad, con un peso aproximado de 320-360 g. Los detalles de los reactivos y equipos utilizados se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Selección y mantenimiento de animales

1. Seleccione un animal sano (peso corporal de ~220-240 g).
2. Asegúrese de que cumplan con los criterios de nivel libre de patógenos específicos (SPF)¹⁵ y se críen de manera adaptativa durante un mínimo de 2 semanas en un entorno con ventilación adecuada (8 a 12 cambios de aire por hora), una temperatura agradable (20-25 °C), humedad adecuada (40%-70%), ruido mínimo (por debajo de 70 decibelios) y un ciclo de luz natural (12 h de luz y 12 h de oscuridad).
3. Durante este período, colóquelos en jaulas limpias estándar a una densidad de tres a cinco por jaula y cambie la ropa de cama dos veces por semana. Proporcionar acceso ad libitum a alimentos y agua, así como a alimentos de mantenimiento estándar para ratas de laboratorio.

2. Preparación preoperatoria

1. Seleccione una rata sana con un peso corporal aproximado de 320 g a 360 g. Ayunar la rata durante 8-12 h antes de la operación y proporcionar acceso a una solución de solución salina fisiológica y glucosa al 5% en una proporción de 1:1 para el consumo voluntario.
2. Preparar los instrumentos microquirúrgicos esterilizados en autoclave (remojo preoperatorio en alcohol durante 1 h), un microscopio, una mesa de disección de ratas, 8-0 Sutura no absorbible de alto peso molecular, sutura no absorbible 4-0, gasas estériles, bastoncillos de algodón estériles, etc.

3. Establecimiento del modelo de bolsa ileal para ratas

1. Inyectar por vía intraperitoneal una solución sódica de pentobarbital al 1% a una dosis de 6 mL/kg e infiltración incisional de anestesia local con ropivacaína al 0,5% para anestesiar a la rata. Mantenga a la rata a una temperatura agradable durante la anestesia con una lámpara eléctrica.
2. Realice la resección colorrectal total siguiendo los siguientes pasos:
   1. Asegure a la rata en decúbito dorsal en un banco anatómico siguiendo un protocolo anestésico satisfactorio. Confirme la profundidad de la anestesia mediante un pellizco en el dedo del pie. Use cortadoras de afeitar para eliminar los restos de cabello y aplique la solución de yodóforo dos veces para la esterilización del campo quirúrgico.
   2. Realizar una incisión en la línea media, de aproximadamente 6 cm de largo, para diseccionar la piel, la fascia de la línea blanca y el peritoneo, proporcionando la entrada a la cavidad abdominal. Use un retractor para exponer la superficie peritoneal y cúbrala con una gasa estéril bacteriostática empapada en solución salina.
   3. Aislar el flujo vascular del yeyuno terminal, ligar su origen mediante un 8-0 hilo de sutura y, posteriormente, cortarlo. Coloque el muñón cecal, ubicado a 1-2 cm de la válvula ileocecal, en reposo y luego córtelo.
   4. Iniciar la resección del hemicolon derecho, ligando el hemicolon derecho y la vena del cólico medio de forma conservadora.
   5. Segregar aún más la arteria mesentérica inferior y aislar la arteria rectal inferior. Continúe el aislamiento por el recto hasta un intervalo que equivalga a dos centímetros desde el borde anal. Resecar oblicuamente el recto distal a unos 45 grados para evitar estenosis postoperatorias.
3. Realice la construcción de la bolsa en J.
   1. Utilice un bisturí de micrótomo para separar la sección transversal del íleon terminal del intestino mesenterio, que debe medir unos 6-7 cm.
   2. Dobla el íleon terminal en forma de J para crear una bolsa para el íleon. Realizar la anastomosis de la pared posterior mediante un punto entrelazado. Aumente la pared anterior con un punto de Connell modificado y conserve un intestino adecuado para que coincida con el tamaño de la sección transversal del muñón rectal distal.
   3. Refuerce la bolsa en forma de J con 8-0 costuras si es necesario. La longitud de la bolsa J debe estar dentro del rango de 2,5 cm a 3,5 cm.
4. Realizar anastomosis ileal-anal de bolsa, IPAA.
   1. Confirmar la ausencia de torsión en el mesenterio y suturar las paredes laterales de la abertura de la bolsa y la pared lateral del muñón rectal a intervalos con un 8-0 Hilo de sutura para tracción.
   2. En última instancia, aplique una sutura de bloqueo continuo de capa completa tanto en la pared anterior como en la posterior.
   3. Verificar la ausencia de sangrado activo y limpiar fisiológicamente la cavidad abdominal con solución salina normal. Cierre secuencialmente la fascia muscular abdominal y la piel con suturas 4-0.
5. Realizar el manejo postoperatorio.
   1. Administrar ketoprofeno como analgesia postoperatoria (40 mg/kg, por vía subcutánea) a todas las ratas tras el cierre abdominal. Asegúrese de calentar la rata con una lámpara eléctrica hasta que se produzca la restauración.
   2. Restrinja el consumo de alimento del animal durante un período mínimo de 72 h después de la operación para reducir el riesgo de obstrucción intestinal. Permitir el acceso a una dieta de 5% de glucosa ad libitum para reponer rápidamente la energía y los líquidos corporales, y ajustar la frecuencia de alimentación según los patrones de defecación.
   3. Una semana después de la cirugía, comience con una nutrición limitada y aumente gradualmente la cantidad consumida. Luego, proporcione a las ratas alimento regular para roedores para que lo consuman libremente, mientras mantiene un registro diario de su ingesta dietética, ingesta de agua y peso corporal.

4. Establecimiento de un modelo de pouchitis ileal de rata con DSS

1. Realizar la agrupación experimental.
   1. Asigne aleatoriamente a 12 ratas que se han sometido a una resección colorrectal total y cirugía de IPAA al grupo de IPAA (Grupo A, n = 6) y al grupo de pouchitis (Grupo B, n = 6).
   2. Prepare una solución de DSS al 4% añadiendo 4 g de DSS a 100 ml de agua pura, recién preparada diariamente.
   3. Administrar el grupo IPAA y el grupo de pouchitis con agua pura o DSS al 4% en el día 31 y 35 del postoperatorio, respectivamente. Permita que las ratas beban y coman libremente comida para ratas durante los cuatro días consecutivos de administración.
2. Realice el muestreo de la bolsa.
   1. En la mañana del día 35, después de la operación, anestesiar a las ratas con una inyección intraperitoneal de solución sódica de pentobarbital al 1%, administrando una dosis de 6 mL/kg (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).
   2. Corte la bolsa perpendicularmente desde el estoma de la bolsa hasta la unión de las bolsas de entrada y salida en cada grupo. Obtén el espécimen de la bolsa.
   3. Abra la bolsa a lo largo de la línea de sutura de la pared anterior y lave el canal intestinal con solución salina.
   4. Coloque un fragmento de tejido de bolsa en un tubo de microcentrífuga y refrigérelo rápidamente a -80 °C. Utilice esta parte para la detección ELISA de indicadores inflamatorios. Fije la sección restante de la bolsa con formaldehído al 10% para la puntuación histopatológica y la tinción inmunohistoquímica.
   5. Por último, eutanasiar a la rata mediante embolia gaseosa bajo anestesia profunda (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente).

5. Análisis histológico

1. Después de adquirir el tejido de la bolsa de la rata, sumérjalo en paraformaldehído al 4% durante 24 h. Posteriormente, proceda con los protocolos de deshidratación e incrustación. Seccionar el tejido procesado para el examen histológico¹⁶.
2. Aplique tinción con hematoxilina y eosina para identificar las diferencias histopatológicas entre los grupos. Examine las muestras microscópicamente y capture fotografías para su documentación.

6. Ensayo inmunohistoquímico

1. Desparafinar y deshidratar las secciones de tejido con cuidado. Luego, realice la recuperación del antígeno enfriando las secciones en una solución de citrato de sodio y bloqueándolas con suero bloqueante durante 20 minutos.
2. Posteriormente, exponer las rodajas al anticuerpo primario anti-ocludina e incubarlas durante la noche a 4 °C. Posteriormente, trátelos con anticuerpos secundarios durante 30 min antes de la contratinción de hematoxilina¹⁶.
3. Una vez que las rodajas se hayan secado, obsérvalas y fotografíalas bajo un microscopio óptico.

7. Prueba ELISA

1. 7.1 Picar y homogeneizar los fragmentos de tejido en tampón de lisis mediante sonicación para garantizar una homogeneización completa. Utilice el sobrenadante resultante para la detección.
2. Asigne pozos para espacios en blanco, muestras y réplicas por grupo. Determine la concentración de proteínas mediante la lectura de la absorbancia a 450 nm (valor OD) y la realización de un análisis de regresión lineal¹⁶.

Resultados

Evaluación del estado general de las ratas modelo de bolsa ileal después del establecimiento
Después de que el operador superó la curva de aprendizaje quirúrgico IPAA, las ratas toleraron bien la cirugía, con una duración quirúrgica de 192,94 min ± 27,15 min, y se produjeron menos complicaciones postoperatorias. Durante el período postoperatorio temprano, las ratas experimentaron una disminución en la ingesta dietética, pero su apetito preoperatorio se res...

Discusión

La colitis ulcerosa (CU) es una inflamación intestinal crónica caracterizada por dolor epigástrico recurrente, diarrea y heces con sangre mucosa. Afecta principalmente al recto y puede afectar al colon en progresión en diversos grados. La cirugía juega un papel crucial en el manejo de la CU 17,18,19. Desde que Parks et ^al.20 introdujeron la colectomía total con un p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anhydrous ethanol	Tianjin Fengchuan Chemical Reagent Technology Co., Ltd	China	Hematoxin-eosin Staining
Dextran Sulfate Sodium	Yeasen	60316ES76	Used to induce pouch inflammation
Formaldehyde solution	Tianjin Zhiyuan Reagent Company	China	Hematoxin-eosin Staining
Gauze	Jiangxi Zhonggan Medical Equipment Company	China	Used for animal microsurgery
Hematoxylin	Beijing Zhongshan Jinqiao Company	China	Hematoxin-eosin Staining
Interferon γ  Detection reagent kit	Cloud-clone	SEA049Ra	Detecting inflammatory factors
Interleukin-10 detection kit	Cloud-clone	SEA056Ra	Detecting inflammatory factors
Interleukin-17 detection kit	Cloud-clone	SEA063Ra	Detecting inflammatory factors
Interleukin-6 detection kit	Cloud-clone	SEA079Ra	Detecting inflammatory factors
Iodophor	Tangpai Medical Equipment Co., Ltd	China	Used for animal microsurgery
Microscopic manipulation instruments	Aesculap	Germany	Used for animal microsurgery
Occludin	abcam	ab216327	Immunohistochemical testing
Sewing needle	Yangzhou Fuda Medical Equipment Co., Ltd	China	Used for animal microsurgery
tumor necrosis factor α Detection reagent kit	Cloud-clone	SEA133Ra	Detecting inflammatory factors
Two person binocular surgical microscope	OPTON	Germany	Used for animal microsurgery
Xylene	Tianjin Yingda Rare and Precious Reagent Factory	China	Hematoxin-eosin Staining