Revelando el fenotipo ferroptótico del meduloblastoma

Resumen

El contenido de hidroperóxido lipídico representa el indicador más comúnmente utilizado de la muerte celular ferroptótica. Este artículo demuestra el análisis paso a paso de la citometría de flujo del contenido de hidroperóxido lipídico en las células tras la inducción de ferroptosis.

Resumen

La interacción del hierro y el oxígeno es una parte integral del desarrollo de la vida en la Tierra. No obstante, esta química única sigue fascinando y desconcertando, lo que lleva a nuevas empresas biológicas. En 2012, un grupo de la Universidad de Columbia reconoció esta interacción como un evento central que conduce a un nuevo tipo de muerte celular regulada llamada "ferroptosis". La característica principal de la ferroptosis es la acumulación de hidroperóxidos lipídicos debido a (1) una defensa antioxidante disfuncional y/o (2) un estrés oxidativo abrumador, que coincide con mayor frecuencia con un mayor contenido de hierro lábil libre en la célula. Normalmente, esto se evita mediante el eje antiferroptótico canónico que comprende el transportador de cistina xCT, el glutatión (GSH) y la GSH peroxidasa 4 (GPx4). Dado que la ferroptosis no es un tipo programado de muerte celular, no involucra las vías de señalización características de la apoptosis. La forma más común de demostrar este tipo de muerte celular es mediante el uso de antioxidantes lipofílicos (vitamina E, ferrostatina-1, etc.) para prevenirla. Estas moléculas pueden acercarse y desintoxicar el daño oxidativo en la membrana plasmática. Otro aspecto importante para revelar el fenotipo ferroptótico es la detección de la acumulación previa de hidroperóxidos lipídicos, para lo cual se utiliza el colorante específico BODIPY C11. El presente manuscrito mostrará cómo se puede inducir ferroptosis en células de meduloblastoma de tipo salvaje mediante el uso de diferentes inductores: erastina, RSL3 y donante de hierro. Del mismo modo, se utilizarán las células xCT-KO que crecen en presencia de NAC y que sufren ferroptosis una vez que se elimina el NAC. El fenotipo característico "burbujeante" es visible bajo el microscopio óptico dentro de las 12-16 h desde el momento del desencadenamiento de la ferroptosis. Además, se utilizará la tinción con BODIPY C11 seguida de un análisis FACS para mostrar la acumulación de hidroperóxidos lipídicos y la consiguiente muerte celular utilizando el método de tinción PI. Para demostrar la naturaleza ferroptótica de la muerte celular, se utilizará la ferrostatina-1 como un agente específico para prevenir la ferroptosis.

Introducción

La ferroptosis es un tipo de muerte celular dependiente de especies reactivas de oxígeno (ROS) recientemente contextualizado¹. Además de las ROS, el hierro desempeña un papel crucial en este tipo de muerte celular, de ahí el nombre². El paso final y ejecutivo de la ferroptosis es la acumulación catalizada por hierro del daño oxidativo de los lípidos en la membrana plasmática que finalmente conduce a un compromiso de la integridad de la membrana y la permeabilidad selectiva y, finalmente, a la muerte celular por burbujeo. El evento de hidroperoxidación lipídica es un fenómeno que ocurre naturalmente; Sin embargo, su propagación a través de la membrana celular es evitada por la defensa antioxidante de la célula. El actor principal en este contexto es la proteína Se glutatión peroxidasa 4 (GPx4), que puede acercarse a la membrana y convertir los hidroperóxidos lipídicos en sus derivados alcohólicos menos tóxicos³. El poder reductor de GPx4 lo aporta principalmente, pero no exclusivamente, el glutatión (GSH), un tripéptido compuesto por los aminoácidos no esenciales: glicina, glutamato y cisteína. El aminoácido limitante de la biosíntesis de GSH es la cisteína⁴. Aunque la cisteína se clasifica como un aminoácido no esencial, sus requisitos pueden superar fácilmente su producción interna en células altamente proliferativas (como las células cancerosas). Por lo tanto, se ha reclasificado en el grupo de los aminoácidos semiesenciales. La importación necesaria de cisteína se produce principalmente a través del sistema Xc-, que permite la importación de la forma oxidada (dominante) de cisteína (también conocida como cistina) a expensas de la exportación de^{glutamato 5}. El sistema Xc- está compuesto por una subunidad de transporte independiente de Na+ y dependiente de Cl, conocida como xCT, y una subunidad chaperona, conocida como CD98. Hasta hace poco, las propiedades antiferroptóticas del eje xCT-GSH-GPx4 se han considerado únicas e irrepetibles⁶. Sin embargo, en 2019, se describió una vía antiferroptótica alternativa, compuesta por ubiquinol (coenzima Q10) y su enzima regenerativa, la proteína supresora de ferroptosis 1 (FSP1) ^7,8. Poco después, se ha descrito otro sistema de desintoxicación de hidroperóxidos lipídicos que involucra GTP ciclohidrolasa-1 / tetrahidrobiopterina (GCH1 / BH4)⁹. No obstante, el papel central del eje xCT-GSH-GPx4 en la prevención de la ferroptosis no parece ser cuestionado.

Durante la última década, la ferroptosis ha sido ampliamente estudiada en una variedad de tipos de tumores, mostrando un gran potencial como estrategia anticancerígena (revisado por Lei et ^al.10). Además, se ha reportado que las células cancerosas que exhiben una alta resistencia a los quimioterapéuticos convencionales y/o una propensión a hacer metástasis son sorprendentemente sensibles a los inductores de ferroptosis, como los inhibidores de GPx4 11,12,13. Sin embargo, en el contexto de los tumores cerebrales, el potencial de los inductores ferroptóticos sigue siendo muy poco estudiado. Si bien este tipo de muerte celular se ha asociado estrechamente con lesiones por isquemia-reperfusión cerebral¹⁴y enfermedades neurodegenerativas¹⁵, su potencial en el contexto de los tumores cerebrales se ha limitado principalmente al glioblastoma, el tumor craneoencefálico maligno más común (revisado por Zhuo et ^al.16). Por otro lado, la sensibilidad del meduloblastoma, el tumor cerebral pediátrico maligno más común y una de las principales causas de mortalidad infantil, a los inductores de ferroptosis sigue siendo en gran medida inexplorada. Hasta donde sabemos, hay escasa literatura revisada por pares que relacione la ferroptosis y el meduloblastoma. Sin embargo, algunos estudios han revelado que el hierro desempeña un papel crucial en la supervivencia, la proliferación y el potencial tumorigénico de las células madre cancerosas (CSC) del meduloblastoma y del glioblastoma17,18, lo que podría hacerlas más vulnerables a la inducción de ferroptosis. Esto es particularmente significativo ya que el meduloblastoma es notorio por su subpoblación de CSC, o células iniciadoras/propagadoras de tumores, que parecen ser en gran medida responsables de la quimiorresistencia tumoral, la diseminación y la recaída¹⁹.

La sensibilidad a la inducción de ferroptosis se investiga típicamente midiendo el contenido/acumulación de hidroperóxido lipídico, que puede o no conducir a la muerte celular. Los inductores de ferroptosis más utilizados son (1) erastina, un inhibidor del transportador xCT²⁰, (2) RSL3, un inhibidor de la enzima GPx4², y/o (3) donantes de hierro, como el citrato de ferroamonio (FAC)²¹. El contenido de hidroperóxido lipídico se evalúa utilizando la sonda selectiva BODIPY 581/591 C11²², que tiene máximos de excitación y emisión a 581/591 nm en su estado reducido. Tras la interacción y oxidación por hidroperóxidos lipídicos, la sonda cambia sus máximos de excitación y emisión a 488/510 nm. Típicamente, un aumento significativo en el contenido de hidroperóxido lipídico precede a la muerte de las células ferroptóticas. Dado que la ferroptosis no es una muerte celular programada, no hay una cascada de señalización molecular que conduzca a su ejecución. Por lo tanto, la única forma de confirmarlo es monitorizar el contenido de hidroperóxidos lipídicos y utilizar inhibidores específicos para este tipo de muerte celular, como la ferrostatina 1²³. La ferrostatina 1 es un antioxidante lipofílico que puede penetrar en el compartimento lipídico de la célula y desintoxicar los hidroperóxidos lipídicos, previniendo así los eventos ferroptóticos.

Protocolo

El presente estudio se llevó a cabo utilizando líneas celulares de meduloblastoma de tipo salvaje (WT) DAOY, que se cultivaron a 37 °C con 5% de CO₂ en medio DMEM suplementado con 8% de FBS. La línea celular con deleción xCT se mantuvo en las mismas condiciones, con experimentos realizados en medios suplementados con 1 mM de N-acetilcisteína (NAC). Las células se examinaron regularmente para detectar micoplasma utilizando un kit de detección de micoplasma disponible comercialmente (ver Tabla de materiales) y se cultivaron hasta el^{décimo paso.}

1. Cosecha y siembra de las células

NOTA: Todos los pasos se realizan utilizando técnicas asépticas estériles en una campana de flujo laminar de cultivo de tejidos. Las células de meduloblastoma DAOY son adherentes, lo que significa que todas las células no adheridas se pueden desechar lavándolas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin Ca²⁺ y Mg²⁺.

1. Tome la placa de caldo (placa de Petri, 100 mm de diámetro) con las celdas y retire las celdas flotantes y el medio de la placa con un aspirador.
2. Agregue 5-10 ml de PBS al plato, lave el fondo con movimientos circulares del plato y luego retire el PBS del plato con un aspirador.
3. Añadir 1 mL de tripsina (dilución 10x) al plato. Incube la placa hasta que un suave golpeteo de la placa desaloje las células. Tome 10 mL de medio de cultivo DMEM suplementado con 8% de FBS y recoja mecánicamente las células de la placa.
4. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 ml.
5. Tome 500 μL de la suspensión celular y colóquela en una cubeta para contar. Cuente el número de células por ml de suspensión celular. Para este estudio se utilizó un contador de células automatizado (ver Tabla de Materiales).
6. Calcule el volumen necesario tomar de la suspensión celular para tener 1,00,000 celdas.
7. Tome una placa de 6 pocillos y agregue el volumen calculado de la suspensión celular en cada pocillo, luego agregue medios de cultivo DMEM suplementados con 8% de FBS a 2 mL en cada pocillo.

2. Tratamiento de las células

NOTA: El control y los tratamientos se realizan por triplicado. Los grupos son los siguientes: Control (DMSO), 1 μM de erastina, 0,3 μM de RSL3, 250 μM de FAC, 2 μM de Ferrostatina 1, 1 μM de erastina + 2 μM de Ferrostatina 1, 0,3 μM de RSL3 + 2 μM de Ferrostatina 1, 250 μM de FAC + 2 μM de Ferrostatina 1. Se necesitan cuatro placas de 6 pocillos para el experimento, como se indica en la Tabla 1). Los detalles comerciales de todos los reactivos necesarios se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. 24 h después de la siembra, añadir el tratamiento correspondiente al pocillo con las celdas.
2. Deje las placas a 37 °C y 5% de_CO2 en la incubadora.

3. Tinción de hidroperóxidos lipídicos de las células tratadas con sonda BODIPY 581/591 C11

NOTA: La solución madre de la sonda específica de hidroperóxido lipídico se prepara en DMSO a una concentración de 1 mM. Las alícuotas de la solución madre se almacenan a -20 °C en tubos no transparentes. Para la tinción, prepare una solución de trabajo de 2 μM de la sonda en medios DMEM suplementados con FBS al 8%.

1. 6 h después del tratamiento, observe las células bajo un microscopio óptico (el redondeo celular debe ser visible).
2. Retire las placas de la incubadora y colóquelas en una campana de flujo laminar para cultivo de tejidos.
   Con un aspirador, extraiga los medios y las células flotantes (muertas).
3. Agregue suavemente 2 ml de PBS a cada pocillo, lave el fondo con movimientos circulares de las placas de 6 pocillos y luego retire el PBS de los pocillos con un aspirador.
4. Añadir 2 mL de la solución de trabajo de la sonda (concentración final de 2 μM en DMEM suplementado con FBS).
5. Deje el plato en la incubadora a 37 °C y 5% de CO₂ durante 30 min en la oscuridad (los platos se pueden envolver en papel de aluminio).

4. Análisis por citometría de flujo del contenido de hidroperóxido lipídico en las células tratadas

NOTA: Todos los siguientes pasos se realizan en la oscuridad (sin luces en la campana de flujo laminar).

1. Saque las placas de la incubadora y colóquelas en una campana de flujo laminar para cultivo de tejidos.
   Con un aspirador, retire la solución de tinción.
2. Agregue suavemente 2 ml de PBS a cada pocillo, lave el fondo con movimientos circulares de las placas de 6 pocillos y luego retire el PBS de los pocillos con un aspirador.
3. Repita el paso de lavado una vez más y aspire cualquier PBS restante del pocillo con un aspirador.
4. Agregue 150 μL de un reactivo de disociación celular disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) en el fondo de cada pocillo e incube la placa hasta que un golpeteo suave de la placa desaloje las células. Tome 250 μL de tampón FACS (PBS, 2 mM EDTA, 0,5% BSA) y recoja mecánicamente las células de los pocillos.
5. Transfiera las celdas al tubo FACS correspondiente (previamente marcado) con la tapa del filtro. Coloque el tubo con las células en hielo en la oscuridad hasta que se realice el análisis (el análisis debe realizarse dentro de una hora después de la tinción).
   NOTA: La configuración y calibración de la máquina FACS dependen de la máquina utilizada (consulte la Tabla de materiales).
6. Crea un nuevo experimento y dale un nombre (Ferroptosis en DAOY - hidroperóxidos lipídicos).
7. En el diseño del experimento, elija el láser (488 nm) y el filtro (FITC).
8. En los datos de visualización, seleccione el tamaño de celda adecuado (>12 μm), establezca los voltajes PMT (la población de celdas debe aparecer en el primer cuadrante del diagrama de puntos SSC-H/FSC-H) y cierre el diagrama de puntos.
9. Agregue un nuevo gráfico: histograma, con FITC-A en el eje y y escala logarítmica.
10. Agite las muestras en el tubo FACS, colóquelas en la máquina FACS y cargue la muestra. Registre 10.000 eventos singlete FSC y asigne un nombre al archivo (por ejemplo, DAOY WT CTL 6h). Exporte el archivo como .fcs.

5. Tinción de yoduro de propidio (PI) de las células muertas durante el tratamiento

NOTA: El diseño del experimento es exactamente el mismo que para la medición de hidroperóxido lipídico (ver paso 1 y paso 2).

1. 24 h después de la siembra, saque los platos de la incubadora y colóquelos en la campana de flujo laminar.
2. Recoja los medios (con células muertas) en un tubo de 15 ml.
3. Agregue 1 mL de PBS a cada pocillo, lave el fondo con movimientos circulares de las placas de 6 pocillos y luego recoja el PBS en el tubo con los medios respectivos.
4. Agregue 200 μL de tripsina (dilución 10x) en el fondo de cada pocillo e incube la placa hasta que un suave golpeteo de la placa desaloje las células. Utilice el medio respectivo + PBS para recolectar las células de los pozos.
5. Centrifugar la suspensión celular a 180 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante con un aspirador.
6. Vuelva a suspender el pellet celular en 300 μL de tampón FACS y colóquelo en hielo hasta el análisis.
7. Justo antes del análisis, agregue la solución de PI (consulte la Tabla de materiales) hasta una concentración final de 2 μg/mL.

6. Análisis por citometría de flujo de células muertas 24h post-tratamiento

NOTA: La configuración y la calibración de la máquina FACS se realizan como se indicó anteriormente (consulte el paso 4).

1. Crea un nuevo experimento y dale un nombre (Ferroptosis en DAOY - muerte celular).
2. En el diseño del experimento, elija el láser (488 nm) y el filtro (PE).
3. En los datos de visualización, seleccione el tamaño de celda adecuado (>12 μm), establezca los voltajes PMT (la población de celdas debe aparecer en el primer cuadrante del diagrama de puntos SSC-H/FSC-H) y cierre el diagrama de puntos.
4. Agregue un nuevo gráfico: histograma, con PE-A en el eje y y escala logarítmica.
5. Agite las muestras en el tubo FACS, colóquelas en la máquina FACS y cargue la muestra.
6. Registre 10.000 eventos singlete FSC y asigne un nombre al archivo (por ejemplo, DAOY WT CTL 6h). Exporte el archivo como .fcs.

7. Análisis por citometría de flujo del contenido de hidroperóxido lipídico en las células DAOY xCT-/-

NOTA: Las celdas xCT-^/- se han generado como se describió anteriormente²⁴.

1. Para este experimento, siembre las células como se indica en el paso 2, pero en lugar del tratamiento, complemente el medio con 1 mM de NAC durante la noche.
2. Al día siguiente, mantenga el NAC en un grupo y retírelo del otro.
3. Realice el análisis de citometría de flujo del contenido de hidroperóxido lipídico exactamente de la misma manera que se describe en el paso 6.

8. Análisis de los resultados del citómetro de flujo

1. Abra el documento .fcs en el software FlowJo (consulte Tabla de materiales).
2. Haga doble clic en el archivo individual para abrir todos los eventos (no solo los singletes FCS) registrados en la muestra individual (diagrama de puntos SSC-A/FSC-A). Dado que la configuración es tal que la compuerta realizada en la máquina no se conserva, es necesario hacer la puerta una vez más y nombrar la población (por ejemplo, DAOY WT).
3. Haga doble clic en la población cerrada para abrir otra ventana con el histograma.
4. Cambie el eje Y al filtro fluorescente utilizado (Comp-FITC/PE-A).
5. Cambie el eje X a modal (normalice cada pico a su modo, es decir, al % del número máximo de celdas que se encuentran en un contenedor en particular).
6. Copie el histograma en el editor de diseño. Repita esto para todas las muestras, y cada vez que se pegue un nuevo histograma en el editor de diseño, arrástrelo sobre el anterior para que los histogramas se superpongan (medio desplazamiento).

Resultados

La línea celular de meduloblastoma DAOY se cultivó en un medio DMEM estándar suplementado con 8% de FBS hasta que alcanzó aproximadamente un 60% de confluencia. El día del experimento, se recolectaron células y se sembraron 1.00.000 células por pocillo en placas de 6 pocillos, según la Tabla 1. Al día siguiente, las células (por triplicado) se trataron con 1 μM de erastina, 0,3 μM de RSL3 o 250 μM de FAC. A continuación, las placas se colocaron en la incubadora a 37 °C y 5% de CO₂

Discusión

La principal característica distintiva de la muerte celular ferroptótica es la acumulación incontrolada de hidroperóxidos lipídicos en la membrana plasmática. Este daño oxidativo puede ocurrir de forma enzimática o no enzimática, pero en ambos casos, la reacción es dependiente/catalizada por hierro, lo que explica el nombre de este tipo de muerte celular. La hidroperoxidación lipídica a menudo se estima indirectamente midiendo los productos de degradación de la hidroperoxidación lipídica, como el 4-hidroxi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
BODIPY 581/591 C11	Thermo Fisher	D3861
Cell counter	Beckman	Coulter Z1
DMEM medium	Gibco	10569010
Erastin	Sigma-Aldrich	E7781-5MG
Ferroamminium citrate	Acros Organics	211842500
Ferrostatin-1	Sigma-Aldrich	SML0583-25MG
Fetal bovin serum (FBS)	Dominique Dutcher	500105N1N
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Melody
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher	11599686
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A7250
PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit	InvivoGen	rep-pt1
propidium iodide	Invitrogen	P3566
RSL3	Sigma-Aldrich	SML2234-25MG
Trypsin - EDTA 10X - 100 mL	Dominique Dutcher	X0930-100