Métodos alternativos para la detección de la generación de aniones superóxido en plaquetas

Resumen

La generación de anión superóxido es esencial para la estimulación de las plaquetas y, si está desregulada, es fundamental para las enfermedades trombóticas. En este trabajo se presentan tres protocolos para la detección selectiva de aniones superóxido y el estudio de la regulación plaquetaria dependiente de redox.

Resumen

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son moléculas que contienen oxígeno altamente inestables. Su inestabilidad química los hace extremadamente reactivos y les da la capacidad de reaccionar con moléculas biológicas importantes como proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Los aniones superóxido son ROS importantes generadas por la reducción de la reducción de oxígeno molecular (es decir, la adquisición de un electrón). A pesar de su implicación inicial exclusivamente en el envejecimiento, los procesos degenerativos y patogénicos, recientemente se ha puesto de manifiesto su participación en importantes respuestas fisiológicas. En el sistema vascular, se ha demostrado que los aniones superóxido modulan la diferenciación y la función de las células del músculo liso vascular, la proliferación y migración de las células endoteliales vasculares en la angiogénesis, la respuesta inmunitaria y la activación de las plaquetas en la hemostasia. El papel de los aniones superóxido es particularmente importante en la desregulación de las plaquetas y las complicaciones cardiovasculares asociadas con una gran cantidad de afecciones, como el cáncer, la infección, la inflamación, la diabetes y la obesidad. Por lo tanto, se ha vuelto extremadamente relevante en la investigación cardiovascular poder medir de manera efectiva la generación de aniones superóxido por parte de las plaquetas humanas, comprender los mecanismos dependientes de redox que regulan el equilibrio entre hemostasia y trombosis y, finalmente, identificar nuevas herramientas farmacológicas para la modulación de las respuestas plaquetarias que conducen a trombosis y complicaciones cardiovasculares. Este estudio presenta tres protocolos experimentales adoptados con éxito para la detección de aniones superóxido en plaquetas y el estudio de los mecanismos dependientes de redox que regulan la hemostasia y la trombosis: 1) detección de aniones superóxido basados en dihidroetidio (DHE) por citometría de flujo; 2) Visualización y análisis de aniones superóxido basados en DHE mediante imágenes de plaquetas individuales; y 3) cuantificación basada en sonda de espín de la salida de aniones superóxido en plaquetas mediante resonancia paramagnética electrónica (EPR).

Introducción

El anión superóxido (_O2^•-) es la ROS funcionalmente más relevante generada en las plaquetas¹. O₂^•- es el producto de la reducción del oxígeno molecular y el precursor de muchas ROS ² diferentes. La dismutación de_O2^•- conduce a la generación de peróxido de hidrógeno (_H2,_O2) a través de reacciones espontáneas en solución acuosa o reacciones catalizadas por superóxido dismutasas (SODs³). Aunque se han sugerido diferentes fuentes enzimáticas (por ejemplo, xantina oxidasa

Protocolo

La recolección de sangre periférica de voluntarios que dan su consentimiento está aprobada por el Comité de Ética local y la Autoridad de Investigación Sanitaria del Servicio Nacional de Salud (referencia REC: 21/SC/0215; IRAS ID: 283854).

1. Método 1: Detección de aniones superóxido mediante DHE por citometría de flujo

1. Precalentar (37 °C) la solución de citrato de sodio (4% p/v) y utilizarla como anticoagulante añadiéndola directamente a la sangre en el momento de la venopunción en una proporción de 1:7 (0,5% p/v final).
2. Extracción de sangre humana periférica de volunta....

Discusión

En este manuscrito, presentamos tres técnicas diferentes con el potencial de avanzar en la capacidad de investigar la regulación dependiente de redox de la función plaquetaria a través de la detección selectiva de_O2^•-. Los dos primeros métodos son una mejora con respecto a las técnicas existentes debido a la sonda redox utilizada (DHE en lugar del más común pero menos confiable DCFDA). Por lo tanto, estas técnicas son de fácil acceso, y la ma.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-02.1-50mg	Reagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria III	BD Biosciences	NA	Flow cytometer
Bovine Serum Albumin	Merck/Sigma	A7030	For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-E.11-BES	EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)	Merck/Sigma	C4963	Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4	Labmedics/Chronolog	NA	Aggregometer
CM radical	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-20.1-100mg	Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-09.1-100mg	Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC)	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-10.1-1g	Reagent for EPR
Dihydroethidium	Thermo Fisher Scientifics	D11347	Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxide	Merck/Sigma	34869	For stock solution preparation
EPR sealing wax plates	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-A.3-VPM	Consumable for EPR
EPR-grade water	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-07.7.1-0.5L	Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasma	Merck/Sigma	F4883	For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 Antibody	BioLegend	303704	Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes	Labmedics/Chronolog	P/N 312	Consumable for incubation in aggregometer
Horm Collagen	Labmedics/Chronolog	P/N 385	For platelet stimulation
ImageJ	National Institutes of Health (NIH)	NA	ImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
Indomethacin	Merck/Sigma	I7378	For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µl	Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH	NOX-G.6.1-50µL	Consumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochloride	Merck/Sigma	P2658	For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)	Merck/Sigma	P5515	For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)	Merck/Sigma	S5770	For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)	Labmedics/Chronolog	P/N 313	Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)	Merck/Sigma	S9549	Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasma	Merck/Sigma	T6884	For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870	Enzo Life Science	BML-EI395	NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscope	Zeiss	NA	Confocal microscope