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Resumen

La generación de anión superóxido es esencial para la estimulación de las plaquetas y, si está desregulada, es fundamental para las enfermedades trombóticas. En este trabajo se presentan tres protocolos para la detección selectiva de aniones superóxido y el estudio de la regulación plaquetaria dependiente de redox.

Resumen

Las especies reactivas de oxígeno (ROS) son moléculas que contienen oxígeno altamente inestables. Su inestabilidad química los hace extremadamente reactivos y les da la capacidad de reaccionar con moléculas biológicas importantes como proteínas, ácidos nucleicos y lípidos. Los aniones superóxido son ROS importantes generadas por la reducción de la reducción de oxígeno molecular (es decir, la adquisición de un electrón). A pesar de su implicación inicial exclusivamente en el envejecimiento, los procesos degenerativos y patogénicos, recientemente se ha puesto de manifiesto su participación en importantes respuestas fisiológicas. En el sistema vascular, se ha demostrado que los aniones superóxido modulan la diferenciación y la función de las células del músculo liso vascular, la proliferación y migración de las células endoteliales vasculares en la angiogénesis, la respuesta inmunitaria y la activación de las plaquetas en la hemostasia. El papel de los aniones superóxido es particularmente importante en la desregulación de las plaquetas y las complicaciones cardiovasculares asociadas con una gran cantidad de afecciones, como el cáncer, la infección, la inflamación, la diabetes y la obesidad. Por lo tanto, se ha vuelto extremadamente relevante en la investigación cardiovascular poder medir de manera efectiva la generación de aniones superóxido por parte de las plaquetas humanas, comprender los mecanismos dependientes de redox que regulan el equilibrio entre hemostasia y trombosis y, finalmente, identificar nuevas herramientas farmacológicas para la modulación de las respuestas plaquetarias que conducen a trombosis y complicaciones cardiovasculares. Este estudio presenta tres protocolos experimentales adoptados con éxito para la detección de aniones superóxido en plaquetas y el estudio de los mecanismos dependientes de redox que regulan la hemostasia y la trombosis: 1) detección de aniones superóxido basados en dihidroetidio (DHE) por citometría de flujo; 2) Visualización y análisis de aniones superóxido basados en DHE mediante imágenes de plaquetas individuales; y 3) cuantificación basada en sonda de espín de la salida de aniones superóxido en plaquetas mediante resonancia paramagnética electrónica (EPR).

Introducción

El anión superóxido (O2•-) es la ROS funcionalmente más relevante generada en las plaquetas1. O2•- es el producto de la reducción del oxígeno molecular y el precursor de muchas ROS 2 diferentes. La dismutación deO2•- conduce a la generación de peróxido de hidrógeno (H2,O2) a través de reacciones espontáneas en solución acuosa o reacciones catalizadas por superóxido dismutasas (SODs3). Aunque se han sugerido diferentes fuentes enzimáticas (por ejemplo, xantina oxidasa4, lipoxigenasa5, ciclooxigenasa6 y óxido nítrico sintasa7), la respiración mitocondrial 8,9 y las nicotinamida adenina dinucleótido fosfato-oxidasas (NOXs)10 son las fuentes más prominentes de anión superóxido en las células eucariotas. Este también parece ser el caso de las plaquetas, donde la fuga de electrones de la respiración mitocondrial11,12 y la actividad enzimática de los NOX13,14 se han descrito como los principales contribuyentes a la producción de aniones superóxido.

Aunque varios estudios se han centrado en la regulación de las plaquetas porO2•-, no existe consenso sobre los mecanismos moleculares responsables. La modulación de la actividad de los receptores de superficie a través de la oxidación directa y la formación de enlaces disulfuro se ha propuesto para diferentes receptores de plaquetas. Se ha sugerido la regulación positiva de la integrina αIIbβ3 por ROS a través de la oxidación directa de residuos de cisteína 15,16,17. De manera similar, dado que las respuestas plaquetarias al colágeno dependen de la dimerización dependiente de disulfuro y la consecuente dimerización de la glicoproteína VI (GPVI)18, se ha propuesto la potenciación de la actividad del receptor por oxidación dependiente deROS19, aunque no completamente probada experimentalmente. Por último, se demostró que la oxidación inducida por ROS de los grupos sulfhidrilo de la glicoproteína Ib (GPIb) promueve la adhesión plaquetaria y la interacción plaqueta-leucocto durante la inflamación20. Por el contrario, como posible consecuencia de la disminución de la oxidación del grupo sulfhidrilo y de la activación del receptor, el desprendimiento del ectodominio de GPVI y GPIb se ve disminuido por las condiciones reductoras21.

También se han propuesto modos de acción independientes de la oxidación directa de los receptores de superficie plaquetaria. Se ha demostrado que las ROS, incluida laO2•-, modulan positivamente el receptor de colágeno GPVI al atenuar la actividad de la proteína tirosina fosfatasa 2 (SHP-2) que contiene la región de homología Src 2, que regula negativamente la cascada de señalización de este receptor22. Además, elO2•- puede generar ONOO- (peroxinitrito) por reacción rápida con el óxido nítrico (NO), que normalmente inhibe las plaquetas a través de la guanilil ciclasa sensible al NO (NO-GC) y la generación del regulador plaquetario negativo GMP cíclico (cGMP)23,24. La disminución resultante en los niveles de NO puede conducir a la potenciación de las plaquetas. Alternativamente, se ha sugerido que la generación deO2•- por NOX2 contribuye a la peroxidación lipídica y a la formación de isoprostano, que es esencial para la activación y adhesión plaquetaria25. Por último, la proteína quinasa 5 (ERK5) regulada por señales extracelulares activada por mitógenos (MAPK), una proteína quinasa propuesta como sensor de estrés redox en las plaquetas26, es activada por O2•- e induce un fenotipo procoagulante en las plaquetas (según lo estimado por la medición de la externalización de la fosfatidilserina basada en citometría de flujo)27.

La desregulación de laO2•- y otras ROS generadas en las plaquetas se ha asociado con la respuesta hemostática exagerada que conduce a complicaciones cardiovasculares trombóticas asociadas con aterosclerosis, diabetes mellitus, hipertensión, obesidad y cáncer28,29. En estos entornos patológicos, la producción de ROS por parte de las plaquetas aumenta, lo que conduce a una potenciación de sus respuestas adhesivas y agregatorias. Además del efecto sobre las respuestas plaquetarias, la producción de radicales libres de las plaquetas puede tener consecuencias sobre otras células sanguíneas y estructuras vasculares, que es un área poco conocida y poco investigada de la salud cardiovascular30. A pesar de nuestra limitada comprensión de los mecanismos moleculares que relacionan el estrés oxidativo con las afecciones trombóticas, la relevancia clínica de los antioxidantes para la protección contra las enfermedades cardiovasculares ha recibido una atención considerable. Se ha demostrado que los niveles plasmáticos de antioxidantes se correlacionan inversamente con el riesgo de desarrollar afecciones cardiovasculares, y se ha demostrado que el consumo de antioxidantes en la dieta protege contra la enfermedad de las arterias coronarias31,32. En consecuencia, el uso de antioxidantes dietéticos ha sido defendido como un enfoque prometedor para la prevención de enfermedades cardiovasculares 33,34,35. Entre los efectos de la generación de ROS en las plaquetas, el aumento de la apoptosis puede tener importantes efectos fisiopatológicos36,37. En general, los protocolos fiables para detectar y cuantificar la producción deO2•- por parte de las plaquetas son cada vez más relevantes en la investigación cardiovascular.

En la actualidad, las técnicas disponibles para la detección de ROS tienen importantes limitaciones de especificidad (es decir, se desconoce la naturaleza química de las moléculas oxidantes detectadas) y fiabilidad (es decir, la interacción no deseada con moléculas biológicas y reactivos experimentales conduce a resultados no fisiológicos sesgados)38,39. El enfoque más utilizado para la detección de ROS en plaquetas se basa en el uso de diacetato de diclorodihidrofluoresceína (DCFDA), que se convierte en diclorodihidrofluoresceína (DCFH) por las esterasas intracelulares y, en consecuencia, en diclorofluoresceína (DCF) altamente fluorescente por oxidantes celulares, incluidos los radicales hidroxilo y los intermedios de peroxidasa-H2O2 40,41. A pesar de su amplio uso, se han planteado serias dudas sobre la fiabilidad de este enfoque para la medición de ROS38 intracelular. De hecho, la oxidación de DCFH a DCF puede ser inducida por iones de metales de transición (por ejemplo, Fe2+) o enzimas que contienen hemo (por ejemplo, citocromos) en lugar de ROS42. Además, el DCFDA es convertido por las peroxidasas celulares en su forma de radicales libres de semiquinona (DCF--), que a su vez se oxida a DCF por reacción con el oxígeno molecular (O2) con la liberación deO2-, lo que conduce a la amplificación artificial de las respuestas oxidativas 41,43,44. Por lo tanto, la detección de ROS intracelulares por DCFDA es útil para obtener información inicial, pero requiere una consideración cautelosa y controles experimentales extensos38,39.

En este estudio se presentan tres técnicas alternativas para la detección y medición del regulador clave de la función plaquetaria O2•-1. La primera técnica es la detección mediante DHE y citometría de flujo, que ofrece ventajas de fiabilidad y especificidad sobre la DCFDA. La segunda técnica propuesta aquí también utiliza DHE, pero el método de detección es la fluorescencia de plaquetas vivas, que permite el estudio de la generación de O2•- tras la señalización plaquetaria con cinética rápida y resolución de una sola célula. Por último, un protocolo basado en el uso de la sonda de espín de hidroxilamina 1-hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH) en experimentos de resonancia EPR ofrece la posibilidad de cuantificar la tasa de generación deO2•- por las plaquetas y compararla en diferentes condiciones.

Protocolo

La recolección de sangre periférica de voluntarios que dan su consentimiento está aprobada por el Comité de Ética local y la Autoridad de Investigación Sanitaria del Servicio Nacional de Salud (referencia REC: 21/SC/0215; IRAS ID: 283854).

1. Método 1: Detección de aniones superóxido mediante DHE por citometría de flujo

  1. Precalentar (37 °C) la solución de citrato de sodio (4% p/v) y utilizarla como anticoagulante añadiéndola directamente a la sangre en el momento de la venopunción en una proporción de 1:7 (0,5% p/v final).
  2. Extracción de sangre humana periférica de voluntarios sanos mediante venopunción de venopunción de venopunción cubital mediana.
  3. Obtener plasma rico en plaquetas (PRP) a partir de sangre total mediante una etapa inicial de centrifugación a 200 x g durante 20 min.
  4. Centrifugar PRP a 500 x g durante 10 min con los inhibidores plaquetarios reversibles indometacina (10 μM) y PGE1 (40 ng/mL).
  5. Vuelva a suspender el pellet de plaquetas resultante en un tampón Tyrode modificado (145 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 10 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetano sulfónico (HEPES), 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucosa, pH 7,3) (37 °C) a una densidad de 2 x 108 plaquetas/mL.
  6. Después del aislamiento, descanse las plaquetas durante 30 min a 37 °C.
  7. Prepare DHE en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de stock de 5 mM.
  8. Añadir DHE a la suspensión de plaquetas a una concentración final de 5 μM (diluir la solución madre de 1 a 1.000, con una concentración final de DMSO del 0,1% v/v) e incubar durante 15 min a 37 °C.
  9. Tratar las plaquetas con agentes farmacológicos y/o eliminadores de ROS durante 15 min antes de la estimulación con los estímulos fisiológicos y las concentraciones deseadas (p. ej., 0,1 unidad/mL de trombina o 3 μg/mL de colágeno).
  10. Después de la estimulación, diluya las suspensiones de plaquetas 1 a 10 en tampón HEPES modificado en frío como hielo.
  11. Para la citometría de flujo, establezca la ganancia de dispersión lateral (SSC) y dispersión directa (FSC) a 40 mV y 220 mV, respectivamente, y utilice diagramas de dispersión a escala logarítmica para visualizar la población de partículas en la suspensión (ejemplo en la Figura 1A).
  12. (OPCIONAL) Inmunotinción de una alícuota de suspensión plaquetaria utilizando un anticuerpo anti-CD41 para identificar la población de eventos correspondientes a las plaquetas (ejemplo en la Figura 1B).
  13. Analice las muestras por citometría de flujo utilizando excitación a 405 nm (láser violeta) y emisión a una longitud de onda de 580 nm, que detecta selectivamente el producto específico del anión superóxido 2-hidroxi-etidio (2OH-Et+) (Figura 2).
    NOTA: La fijación con paraformaldehído y el almacenamiento de muestras a largo plazo no son aconsejables.

2. Método 2: Detección de aniones superóxido mediante DHE mediante imágenes de fluorescencia de una sola plaqueta

  1. El día del experimento, cubra un portaobjetos de μ de 8 pocillos con 0,1 mg/ml de colágeno fibrilar I de tendones equinos (colágeno Horm), 0,2 mg/ml de fibrinógeno o 1 mg/ml de poli-L-lisina (PLL) en tampón Tyrode modificado durante 2 h a 37 °C.
  2. Lavar dos veces con tampón Tyrode modificado (10 min cada uno).
  3. Enfriar la adherencia inespecífica mediante incubación en tampón Tyrode modificado más 5 mg/mL de albúmina sérica bovina (BSA) durante un mínimo de 30 min (o hasta el experimento).
  4. Precalentar (37 °C) la solución de citrato de sodio (4% p/v) y utilizarla como anticoagulante añadiéndola directamente a la sangre en el momento de la venopunción en una proporción de 1:7 (0,5% p/v final).
  5. Extracción de sangre humana periférica de voluntarios sanos mediante venopunción de venopunción de venopunción cubital mediana.
  6. Obtener plasma rico en plaquetas (PRP) a partir de sangre total mediante una etapa inicial de centrifugación a 200 x g durante 20 min.
  7. Centrifugar PRP a 500 x g durante 10 min con los inhibidores plaquetarios reversibles indometacina (10 μM) y PGE1 (40 ng/mL).
  8. Vuelva a suspender el gránulo de plaquetas resultante en un tampón Tyrode modificado (145 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucosa, pH 7,3) (37 °C) a una densidad de 4 x 107 plaquetas/mL.
  9. Después del aislamiento, descanse las plaquetas durante 30 min a 37 °C.
  10. Prepare DHE en dimetilsulfóxido (DMSO) a una concentración de stock de 10 mM.
  11. Añadir DHE a una concentración final de 10 μM a la suspensión de plaquetas (diluir la solución madre de 1 a 1.000, con una concentración final de DMSO del 0,1% v/v) e incubar durante 1 min (37 °C).
  12. Después de 1 minuto de incubación con DHE, retire la solución de bloqueo de los pocillos elegidos, coloque el portaobjetos de μ en la platina del microscopio listo para la obtención de imágenes y dispense suavemente las plaquetas.
  13. Monitorice la conversión de DHE a 2OH-Et+ mediante imágenes confocales invertidas durante 10 minutos (405/580 nm ex/em), con imágenes recogidas cada 10 s con una lente de inmersión en aceite de 40x.
  14. (OPCIONAL) En el caso de pocillos recubiertos con PLL, se monitoriza la generación de aniones superóxido en respuesta a un agonista soluble (por ejemplo, 0,1 unidades/ml de trombina o 3 μg/ml de colágeno) añadiendo el agonista 10 minutos después de la dispensación de plaquetas y la recogida de imágenes de fluorescencia durante otros 10 minutos, como se describe en el paso 2.13.
  15. (OPCIONAL) Si es necesario, agregue eliminadores de aniones de superóxido o inhibidores selectivos (por ejemplo, inhibidor de NOX) dispensando suavemente al costado del pocillo durante el curso del tiempo y recoja imágenes de fluorescencia como se describe en 2.13 durante 10 minutos más.
  16. Cuantifique el análisis de fluorescencia de una sola célula seleccionando la región de interés (ROI) que contiene plaquetas individuales representativas y analizando la intensidad de fluorescencia en diferentes fotogramas con la herramienta Medir del conjunto de imágenes ImageJ 1.53t.

3. Método 3: Detección de aniones superóxido por plaquetas mediante resonancia paramagnética electrónica (EPR)

  1. Precalentar (37 °C) la solución de citrato de sodio (4% p/v) y utilizarla como anticoagulante añadiéndola directamente a la sangre en el momento de la venopunción en una proporción de 1:7 (0,5% p/v final).
  2. Extracción de sangre humana periférica de voluntarios sanos mediante venopunción de venopunción de venopunción cubital mediana.
  3. Obtener plasma rico en plaquetas (PRP) a partir de sangre total mediante una etapa inicial de centrifugación a 200 x g durante 20 min.
  4. Centrifugar PRP a 500 x g durante 10 min con los inhibidores plaquetarios reversibles indometacina (10 μM) y PGE1 (40 ng/mL).
  5. Vuelva a suspender el pellet de plaquetas resultante en un tampón Tyrode modificado (145 mM de NaCl, 2,9 mM de KCl, 10 mM de HEPES, 1 mM de MgCl2, 5 mM de glucosa, pH 7,3) (37 °C) a una densidad de 2 x 108 plaquetas/mL.
  6. Después del aislamiento, descanse las plaquetas durante 30 min a 37 °C.
  7. Añadir 5 μM de dietilditiocarbamato (DETC) y 25 μM de deferoxamina a la suspensión plaquetaria.
  8. Sin incubación, añadir 200 μM de 1-hidroxi-3-metoxicarbonil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidina (CMH).
  9. Cargue muestras en el agregador dentro de cubetas de agregación (incluidos los imanes de agitación recubiertos de teflón).
  10. Después de 1 min, agregue los estímulos a la concentración deseada (por ejemplo, 1 unidad/ml de trombina o 3 μg/ml de colágeno). Incubar durante 10 min.
  11. (OPCIONAL) Obtenga la generación de aniones superóxido en diferentes puntos de tiempo procediendo al paso 3.12 en el momento deseado.
  12. Transfiera la suspensión de plaquetas de la cubeta de agregación a un tubo de microcentrífuga y gire rápidamente a 6.000 x g durante 10 s.
  13. Cargue 50 μL del sobrenadante en micropipetas capilares y selle con cera de sellado EPR.
  14. Transfiera las muestras al escáner EPR.
  15. Configure el escáner EPR de la siguiente manera: campo central 3.492,5 G, barrido de campo 60 G, amplitud de modulación 2 G, tiempo de barrido 10 s, número de exploraciones 10, frecuencia de microondas 9,39 GHz, potencia de microondas 20 mW, tiempo de conversión 327,68 ms, constante de tiempo 5242,88 ms.
  16. Estime la oxidación de CMH a CM● como el área bajo la curva (AUC) de los picos de EPR registrados utilizando los parámetros anteriores.
  17. Construya una curva de calibración que trace la intensidad de EPR medida como se describe en el paso 3.16 en el eje y y las concentraciones del CM● disponible comercialmente en el eje x (por ejemplo, 0, 0,3, 1, 3, 10 y 30 μM).
  18. A partir de la concentración de CM● en las muestras, obtenga la cantidad de anión superóxido generado por las plaquetas en las muestras utilizando las fórmulas descritas en la sección Resultados representativos.

Resultados

Para la detección por citometría de flujo de fluorescencia de DHE, mostramos resultados representativos de las plaquetas en reposo (Figura 3A) o estimuladas con 0,1 unidades/mL de trombina (Figura 3B). La salida deO2•- se cuantificó como intensidad de fluorescencia media plaquetaria (MFI), como se muestra para la estimulación con 0,1 unidades/mL de trombina (Figura 3C

Discusión

En este manuscrito, presentamos tres técnicas diferentes con el potencial de avanzar en la capacidad de investigar la regulación dependiente de redox de la función plaquetaria a través de la detección selectiva deO2•-. Los dos primeros métodos son una mejora con respecto a las técnicas existentes debido a la sonda redox utilizada (DHE en lugar del más común pero menos confiable DCFDA). Por lo tanto, estas técnicas son de fácil acceso, y la ma...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por la Fundación Británica del Corazón (PG/15/40/31522), Alzheimer Research UK (ARUK-PG2017A-3) y el Consejo Europeo de Investigación (#10102507) a G. Pula.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1-hydroxy-3-methoxycarbonyl-2,2,5,5-tetramethylpyrrolidine (CMH)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-02.1-50mgReagent for EPR (spin probe)
BD FACSAria IIIBD Biosciences NAFlow cytometer
Bovine Serum AlbuminMerck/SigmaA7030For μ-slide coating
Bruker E-scan M (Noxyscan)Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbH NOX-E.11-BES EPR spectrometer
Catalase–polyethylene glycol (PEG-Cat.)Merck/SigmaC4963Hydrogen peroxide scavenger (specificity control)
ChronoLog Model 490+4Labmedics/ChronologNAAggregometer
CM radicalNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-20.1-100mg Reagent for EPR (calibration control)
deferoxamine Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-09.1-100mg Reagent for EPR
diethyldithiocarbamate (DETC) Noxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-10.1-1g Reagent for EPR
DihydroethidiumThermo Fisher ScientificsD11347Superoxide anion probe
Dimethyl sulfoxideMerck/Sigma34869For stock solution preparation 
EPR sealing wax platesNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-A.3-VPMConsumable for EPR
EPR-grade waterNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-07.7.1-0.5L Reagent for EPR
Fibrinogen from human plasmaMerck/SigmaF4883For μ-slide coating
FITC anti-human CD41 AntibodyBioLegend303704Platelet-specific staining for flow cytometry
Glass cuvettes Labmedics/ChronologP/N 312Consumable for incubation in aggregometer
Horm CollagenLabmedics/ChronologP/N 385For platelet stimulation
ImageJ National Institutes of Health (NIH)NAImageJ 1.53t (Wayne Rasband)
IndomethacinMerck/SigmaI7378For platelet isolation
Micropipettes DURAN 50µlNoxygen Science trasfer and Diagnostics GmbHNOX-G.6.1-50µLConsumable for EPR
Poly-L-lysine hydrochlorideMerck/SigmaP2658For μ-slide coating
Prostaglandin E1 (PGE1)Merck/SigmaP5515For platelet isolation
Sodium citrate (4% w/v solution)Merck/SigmaS5770For platelet isolation
Stirring bars (Teflon-coated)Labmedics/ChronologP/N 313Consumable for incubation in aggregometer
Superoxide dismutase–polyethylene glycol (PEG-SOD)Merck/SigmaS9549Superoxide anion scavenger (specificity control)
Thrombin from human plasmaMerck/SigmaT6884For platelet stimulation and μ-slide coating
VAS2870Enzo Life ScienceBML-EI395NOX inhibitor
Zeiss 510 LSM confocal microscopeZeissNAConfocal microscope

Referencias

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