Evaluación de la ruptura de la barrera hematoencefálica en un modelo de ratón de lesión cerebral traumática leve

Resumen

Se desarrolló un método para visualizar la extravasación del tinte debido a la ruptura de la barrera hematoencefálica (BBB) mediante la administración de dos tintes fluorescentes a ratones en diferentes puntos de tiempo. El uso de glicerol como crioprotector facilitó la inmunohistoquímica en la misma muestra.

Resumen

Los tintes fluorescentes se utilizan para determinar el grado de extravasación del tinte que se produce debido a la ruptura de la barrera hematoencefálica (BBB). El marcaje con estos colorantes es un proceso complejo influenciado por varios factores, como la concentración de colorantes en la sangre, la permeabilidad de los vasos cerebrales, la duración de la extravasación del tinte y la reducción de la concentración de colorantes en el tejido debido a la degradación y difusión. En un modelo de lesión cerebral traumática leve, la exposición a las ondas de choque inducidas por explosiones (BSW) desencadena la ruptura de la BHE dentro de un período de tiempo limitado. Para determinar la secuencia precisa de la degradación de la BBB, se inyectó azul de Evans e isotiocianato-dextrano de fluoresceína por vía intravascular e intracardíaca en ratones en varios puntos de tiempo relacionados con la exposición a BSW. A continuación, se registró la distribución de la fluorescencia del colorante en los cortes de cerebro. Las diferencias en la distribución e intensidad entre los dos colorantes revelaron la secuencia espacio-temporal de la ruptura de la BBB. La inmunotinción de los cortes de cerebro mostró que las respuestas astrocíticas y microgliales se correlacionaron con los sitios de descomposición de la BBB. Este protocolo tiene un amplio potencial de aplicación en estudios que involucran diferentes modelos de desglose de BBB.

Introducción

La ruptura y disfunción de la barrera hematoencefálica (BBB) es causada por inflamación sistémica, infecciones, enfermedades autoinmunes, lesiones^{y enfermedades} neurodegenerativas. En el traumatismo craneoencefálico leve (TCEm) resultante de la exposición a ondas de choque inducidas por explosiones (BSW), se ha observado una correlación significativa entre la intensidad de las BSW y la cantidad de fuga de colorante fluorescente debido a la degradación de la BHE ^2,3,4. Una característica notable de la degradación de la BHE en el TCE leve es que comienza inmediatamente o a las pocas horas después de la exposición a los BSW y suele ser un proceso transitorio que dura aproximadamente una semana antes de que surjan trastornos neurológicos crónicos tardíos 3,5,6,7. Aunque los detalles siguen sin estar claros, la degradación de la BHE es parte de la cascada patológica de larga duración y también puede servir como factor pronóstico en el mTBI⁶. Por lo tanto, es importante comprender las distribuciones espaciales y temporales de la descomposición de la BHE en el cerebro.

Los tintes fluorescentes se utilizan para determinar el grado de descomposición de la BBB ^3,8. Debido a que la concentración sanguínea de los tintes y la magnitud y el alcance de la descomposición de la BHE cambian con el tiempo, se requiere precaución al interpretar las imágenes de la extravasación del colorante. Por ejemplo, la ausencia de extravasación del tinte no indica necesariamente la ausencia de descomposición de la BBB. Es posible que no se detecte una descomposición de la BHE antes o después de un aumento en la concentración del tinte en la sangre. Incluso si el tinte se acumuló con éxito donde ocurrió la descomposición de BBB, es posible que se haya perdido con el tiempo después de que cesó la descomposición. En general, las sustancias solubles en agua y biológicamente inertes se excretan rápidamente en la orina⁹. Por lo tanto, para determinar si la descomposición de la BHE se produce en un momento específico, los resultados más fiables se obtienen cuando se administra un colorante fluorescente en el torrente sanguíneo durante un corto período inmediatamente antes de fijar al animal. De esta manera, se debe utilizar el isotiocianato de fluoresceína (FITC)-dextrano disponible en el mercado con un peso molecular específico.

El azul de Evans es un colorante azoico azul ampliamente reconocido con una fuerte afinidad por la albúmina sérica. El colorante exhibe fluorescencia roja cuando es excitado por la luz verde en los sistemas biológicos². Debido a su naturaleza inerte, el complejo albúmina azul-sérica de Evans permanece en la sangre hasta 2 h, lo que lo convierte en un trazador útil de 69 kDa para marcar regiones con una BHE comprometida durante al menos esta duración ^10,11. Por lo tanto, es importante tener en cuenta las posibles incertidumbres en torno a la farmacocinética y la toxicidad del azul de Evans⁹. Sin embargo, un estudio reciente mostró que el azul de Evans continúa acumulándose en áreas donde la BBB está ausente o alterada⁷. Esta característica permitió a Evans Blue registrar el historial de la avería de la BBB, mientras que FITC-dextrano se utilizó para registrar la avería de la BBB en un momento específico después de la exposición a la BSW. Aunque el azul de Evans puede administrarse por vía intravenosa o^{intraperitoneal 10}, se prefiere la administración intravenosa para los experimentos sensibles al tiempo. Este estudio tuvo como objetivo demostrar el uso del azul de Evans y el dextrano FITC para detectar la distribución espacio-temporal de la degradación de la BHE tras la exposición a BSW.

En segundo lugar, el estudio presentó una técnica para congelar cortes de cerebro después de observar la fluorescencia de la descomposición de BBB y preparar cortes más delgados adecuados para procedimientos inmunohistoquímicos. El uso de glicerol como medio de montaje y crioprotector simplifica el proceso de inmunohistoquímica. Al comparar las imágenes de la degradación de la BHE con las de la inmunohistoquímica, la distribución espacio-temporal de la degradación de la BHE se puede correlacionar con la respuesta tisular de la misma muestra.

Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices éticas para experimentos con animales establecidas por el Colegio Médico de Defensa Nacional (Tokorozawa, Japón). El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité de Investigación Animal del Colegio Médico de Defensa Nacional (aprobación n.º 23011-1). En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J de 8 semanas de edad y entre 19 y 23 g de peso. Como se ilustra en la Figura 1, se realizó una única inyección de azul de Evans y perfusión de FITC-dextrano en varios puntos temporales en relación con una sola exposición a BSW. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Anestesia

NOTA: Se trata de un protocolo modificado que aumenta la cantidad de medetomidina 2,5 veces en comparación con el original¹². Las dosis de clorhidrato de medetomidina, midazolam y butorfanol fueron de 0,75 mg/kg, 4 mg/kg y 5 mg/kg, respectivamente.

1. Prepare una mezcla de clorhidrato de medetomidina (75 μg/mL), midazolam (400 μg/mL) y butorfanol (500 μg/mL) en solución salina fisiológica.
2. Administrar la mezcla por vía intraperitoneal para anestesiar al ratón (10 μL/g)¹³.
3. Después de aproximadamente 5-10 minutos, verifique que haya suficiente anestesia observando la falta de pinzamiento de la cola y los reflejos de retirada del pedal.
4. Mantenga el ratón caliente hasta que se recupere de los efectos de la anestesia.

2. Exposición a BSW

NOTA: En este estudio se utilizó un tubo de choque interno¹⁴.

1. Anestesia al ratón como se describe en el paso 1.
2. Coloque el ratón a 5 cm del extremo de salida del tubo de choque, asegurándose de que el eje de su cuerpo esté paralelo al eje del tubo, pero no alineado con él.
3. Proporcione una sola exposición BSW con una sobrepresión máxima de 25 kPa a la cabeza.
   NOTA: Mantenga el ratón caliente hasta que se recupere de los efectos de la anestesia. Supervise regularmente el estado del ratón tratado. Si se observan signos de angustia, como dificultad para alimentarse o beber, encorvarse o una apariencia anormal prolongada sin signos de recuperación, eutanasia al ratón y finalizar el experimento antes de tiempo. Evite administrar analgésicos, ya que pueden afectar potencialmente la respuesta glial.

3. Inyección de azul Evans en la vena de la cola

NOTA: La solución azul de Evans debe administrarse por vía intravenosa sin anestesia. En presencia de anestesia, el tinte a menudo no penetra lo suficiente en el cuerpo, probablemente debido a la disminución de la presión arterial y la temperatura corporal¹³. El azul de Evans se administró a una dosis de 100 mg/kg.

1. Prepare la solución azul de Evans (4% p/v en solución salina) en un microtubo, luego en un vórtice y guárdela en la oscuridad antes de usarla.
2. Inyectar la solución en la vena de cola (2,5 μL/g)¹³.

4. Perfusión transcárdica con solución y fijación de FITC-dextrano

1. Agregue heparina a la solución salina tamponada con fosfato (PBS) para obtener una concentración de 1 U/mL, luego agregue FITC-dextrano al PBS heparinizado para lograr una concentración de 3 mg/mL.
2. Disuelva completamente el polvo de FITC-dextrano antes de usar. Para hacer esto, agite suavemente la solución durante 30 minutos o más. Antes de usar, compruebe cuidadosamente si hay polvo de FITC-dextrano no disuelto. Si queda algo, continúe agitando hasta que se disuelva por completo.
3. Anestesia al ratón como se describe en el paso 1.
4. Continuar con el protocolo estándar de fijación de perfusión utilizando una bomba peristáltica ^15,16. En primer lugar, perfundir con PBS heparinizado que contenga FITC-dextrano durante 2 min a una velocidad de 4,0 mL/min. A continuación, perfundir con una solución tampón neutra de formalina al 10% o paraformaldehído-PBS al 4% durante 2 min a una velocidad de 4,0 mL/min, seguido de 8 min a una tasa de 3,5 mL/min.
5. Extraer cuidadosamente el cerebro con tijeras quirúrgicas y pinzas^15,16. Después de la disección, fije el cerebro durante la noche en el mismo fijador (es decir, una solución tampón de formalina neutra al 10% o paraformaldehído-PBS al 4%) a 4 °C.
6. Al día siguiente, reemplace el fijador por PBS.

5. Procesamiento del tejido cerebral

NOTA: Incluso si la fijación de perfusión es completa, el azul de Evans y el FITC-dextrano pueden dispersarse en el tampón. Por lo tanto, los procedimientos que conducen al paso 6.8 deben completarse dentro de una semana después de la fijación por perfusión. Además, evite exponer la muestra a la luz.

1. Prepare una placa de 24 pocillos con 500 μL de glicerol al 20% en tampón de fosfato (PB; pH 7,4) en cada pocillo.
2. Con una cortadora de cerebros, corte el cerebro coronalmente en 12 rodajas, cada una de 1 mm de grosor.
3. Transfiera cada rebanada al pocillo correspondiente de la placa de 24 pocillos y guárdela a 4 °C durante al menos 2 h.
4. Sustituya la solución por glicerol-PB al 50% y guárdela a 4 °C durante al menos 2 h.
5. Finalmente, reemplace la solución con glicerol al 100%. Para una observación microscópica inmediata, deje reposar las rodajas durante al menos 2 h a temperatura ambiente o guárdelas a 4 °C. Las rebanadas ahora serán translúcidas y estarán listas para la observación microscópica.

6. Medición de fluorescencia de la extravasación del colorante

NOTA: La eficiencia del etiquetado de fluorescencia varía de un ratón a otro. Por lo tanto, es necesario normalizar la intensidad de la fluorescencia. Los valores de fluorescencia se expresan en relación con los del núcleo reticular gigantecelular (GRN) porque esta región se ve mínimamente afectada por el tratamiento con BSW.

1. Añade 500 μL de glicerol al fondo de un plato con fondo de cristal de 35 mm.
2. Transfiera la rodaja a la solución de glicerol y cubra su superficie con un cubreobjetos.
3. Retire el exceso de glicerol del borde del cubreobjetos.
4. Mida la intensidad de fluorescencia del corte bajo un microscopio de fluorescencia.
5. Después de la medición microscópica, devuelva la rebanada al pocillo.
6. Repita la medida para las 12 rebanadas.
7. Agregue 500 μL de PB a cada pocillo y almacene la placa de 24 pocillos a 4 °C durante la noche; al día siguiente, las rodajas estarán saturadas con un 50% de glicerol-PB.
8. Sustituya la solución por glicerol-PB al 30% y guárdela a 4 °C durante al menos 2 h.
9. Realice los procedimientos del paso 7 en unas pocas semanas.

7. Crioseccionamiento e inmunohistoquímica

1. Prepare una placa de 24 pocillos agregando 1000 μL de una mezcla de volúmenes iguales de medio de congelación de tejidos y 30% de glicerol-PB al pocillo 1. A continuación, añadir 1000 μL de medio de congelación de tejidos al pocillo 2.
2. Transfiera la loncha al pocillo 1 y agite el plato a 4 °C durante 1 h.
3. Transfiera la loncha al pocillo 2 y agite el plato a 4 °C durante 1 h.
4. Congele rápidamente la rebanada con isopentano usando hielo seco, teniendo cuidado de no doblar la rebanada. Almacene las rodajas a -80 °C hasta la criosección.
5. Crioseccione el corte hasta un grosor de 6 μm. Después del secado en el portaobjetos del microscopio, almacene las secciones a -80 °C.
6. Para la recuperación del antígeno¹⁷, sumerja las secciones en citrato de sodio 10 mM (pH 6,0), caliente a 100 °C una vez y luego manténgalo a 98 °C durante 1 h.
7. Lave las secciones abundantemente en agua destilada. Las secciones ya están listas para la tinción inmunohistoquímica.

Resultados

La Figura 1A muestra el curso temporal de la inyección de colorante en relación con el inicio de BSW, con una sobrepresión máxima de 25 kPa. En el protocolo 'Post', la solución azul de Evans se administró por vía intravascular 2 h antes de la perfusión con FITC-dextrano, que se llevó a cabo 6 h, 1 día, 3 días y 7 días después de la exposición a BSW. En el protocolo 'Pre', la solución azul de Evans se inyectó inmediatamente antes de la exposic...

Discusión

Se utilizó una novedosa técnica de doble marcaje que utilizó azul de Evans y FITC-dextrano para visualizar con precisión la distribución espacio-temporal precisa de la descomposición de la BBB en un solo cerebro. En el modelo BSW de baja intensidad, se observaron variaciones notables en la extensión, ubicación y grado de extravasación del tinte en los cerebros examinados (Figura 2 y Figura 3). Las discordancias entre ti...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin Neutral Buffer Solution	FUJIFILM Wako Chemicals	062-01661
Anti GFAP, Rabbit	DAKO-Agilent	IR524
Anti Iba1, Rabbit	FUJIFILM Wako Chemicals	019-19741
Chicken anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21200
Cryo Mount	Muto Pure Chemicals	33351	tissue freezing medium
Domitor	Orion Corporation		medetomidine
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10040
Evans Blue	Sigma-Aldrich	E2129
Falcon 24-well Polystyrene Clear Flat Bottom Not Treated Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile, 50/Case	CORNING	351147
Fluorescein isothiocyanate–dextran average mol wt 40,000	Sigma-Aldrich	FD40S	FITC-dextran
Glass Base Dish 27mm (No.1 Glass)	AGC TECHNO GLASS	3910-035	35 mm glass bottom dish
IX83 Inverted Microscope	OLYMPUS
MAS Hydrophilic Adhesion Microscope Slides	Matsunami Glass	MAS-04
Matsunami Cover Glass (No.1) 18 x 18mm	Matsunami Glass	C018181
Midazolam Injection 10mg [SANDOZ]	Sandoz
Paraformaldehyde EMPROVE ESSENTIAL DAC	Merck Millipore	1.04005.1000
Peristaltic Pump	ATTO	SJ-1211 II-H
RODENT BRAIN MATRIX Adult Mouse, 30 g, Coronal	ASI INSTRUMENTS	RBM-2000C	brain slicer
Vetorphale	Meiji Animal Health	VETLI5	butorphanol