Imágenes en vivo para cuantificar la radiosensibilidad celular en organoides tumorales derivados de pacientes

Resumen

Aquí, detallamos un enfoque sencillo de imágenes en vivo para cuantificar la sensibilidad de los organoides tumorales derivados del paciente a la radiación ionizante.

Resumen

La radioterapia (RT) es uno de los pilares del tratamiento clínico moderno del cáncer. Sin embargo, no todos los tipos de cáncer son igualmente sensibles a la irradiación, a menudo (pero no siempre) debido a las diferencias en la capacidad de las células malignas para reparar el daño oxidativo del ADN provocado por los rayos ionizantes. Los ensayos clonogénicos se han empleado durante décadas para evaluar la sensibilidad de las células cancerosas cultivadas a la irradiación ionizante, en gran parte porque las células cancerosas irradiadas a menudo mueren de una manera tardía que es difícil de cuantificar con técnicas asistidas por citometría de flujo o microscopía a corto plazo. Desafortunadamente, los ensayos clonogénicos no se pueden emplear como tales para modelos tumorales más complejos, como los organoides tumorales derivados del paciente (PDTO). De hecho, la irradiación de PDTOs establecidas no necesariamente puede abrogar su crecimiento como unidades multicelulares, a menos que su compartimento en forma de tallo sea completamente erradicado. Además, es posible que la irradiación de suspensiones unicelulares derivadas de PDTO no recapitule adecuadamente la sensibilidad de las células malignas a la RT en el contexto de las PDTO establecidas. Aquí, detallamos una adaptación de los ensayos clonogénicos convencionales que implica la exposición de PDTOs establecidas a radiación ionizante, seguida de disociación de una sola célula, replateado en condiciones de cultivo adecuadas e imágenes en vivo. Las células madre no irradiadas (control) derivadas de la PDTO reforman las PDTO en crecimiento con una eficiencia específica de la PDTO, que se ve influenciada negativamente por la irradiación en función de la dosis. En estas condiciones, la eficiencia de formación de PDTO y la tasa de crecimiento se pueden cuantificar como una medida de radiosensibilidad en imágenes de lapso de tiempo recopiladas hasta que las PDTO de control alcanzan una ocupación de espacio predefinida.

Introducción

La radioterapia (RT) de haz externo es uno de los pilares de la oncología moderna, ya que refleja no solo una pronunciada actividad anticancerosa asociada a un espectro bien definido de efectos secundarios generalmente manejables¹, sino también una disponibilidad clínica excepcionalmente amplia (la mayoría de los centros oncológicos de los países desarrollados están equipados con modernos aceleradores lineales para la RT de haz externo)². De acuerdo con esta noción, la RT se emplea globalmente con éxito tanto con fines curativos, generalmente en el contexto de^{la enferme....}

Protocolo

Los reactivos y equipos utilizados en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Cultivo de organoides

NOTA: Las PDTOs TNBC#1 se establecieron en nuestro laboratorio a partir de tejido tumoral extirpado quirúrgicamente de una paciente con cáncer de mama triple negativo (TNBC) que dio su consentimiento informado para participar en un protocolo de biobanco (IRB21-06023682). Después de la validación por histología y secuenciación de ARN (RNAseq), las PDTOs TNBC#1 se cultivan en gotas de matrigel al 66% (las llamadas 'domos') en un medio de c....

Discusión

Aquí, describimos una adaptación de los ensayos clonogénicos convencionales que aprovechan las PDTO del cáncer de mama y las imágenes en vivo para cuantificar la radiosensibilidad de la PDTO en función de (1) la persistencia de las células madre formadoras de PTDO tras la irradiación de PDTO in vitro, y (2) la tasa de crecimiento de las PDTO que estas células (pueden) generar. Los pasos críticos de este protocolo incluyen (1) el establecimiento de PDTO para una ocupaci.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
40 µm mesh filter	Thomas Scientific	1164H35
B27	Invitrogen	17504-044
Cellometer Auto T4 Bright Field Cell Counter	Nexcelom
DMEM F/12	Corning	12634-010
Epidermal Growth Factor hEGF	Peprotech	AF-100-15
EVOS FL Digital Inverted Fluorescence Microscope	Thermo Fisher Scientific	12-563-460
FGF10	Peprotech	100-26
FGF7	Peprotech	100-19
GlutaMax	Invitrogen	35050061
Hepes	Invitrogen	15630-080
IncuCyte software 2021A	Sartorius		version: 2021A
Incucyte SX1	Sartorius		model SX1
Incucyte validated 48 well plate	Corning	3548
Matrigel	Discovery Labware	354230
nAc	Sigma Aldrich	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Noggin			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Non-treated 6 well plate	Cellstar	657 185
NR (Heregulin)	Peprotech	100-03
p38 MAP inhibitor p38i SB202190	Sigma Aldrich	S7067
PBS	Corning	21-040-CV
PenStrep	Invitrogen	15140-122
Primocin	Invivogen	ant-pm-1
Rspondin Media			Purchased from the Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell, NY, USA
Small Animal Radiation Research Platform (SARRP)	Xstrahl Ltd
TGFbeta Receptor Inhibitor A83-01	Tocris	2939
Trypan blue Stain (0.4%)	Gibco	15250-61
TrypLE	Gibco	112605-028
Y-27632 (RhoKi)	Selleck	S1049