Un modelo preclínico de miopatía inducida por sepsis con desuso en ratones

Resumen

Este modelo murino combina una lesión séptica con el desuso muscular de las extremidades posteriores para recapitular la característica postrada en cama del paciente séptico típico. El modelo representa una desviación significativa de los modelos anteriores para estudiar la disfunción muscular en la sepsis y es un enfoque reproducible para abordar las estrategias terapéuticas para tratar esta afección.

Resumen

La sepsis es una de las principales causas de muerte intrahospitalaria. Las mejoras en el tratamiento dan como resultado un mayor número de sobrevivientes de sepsis. Aproximadamente el 75% de los supervivientes desarrollan debilidad muscular y atrofia, lo que aumenta la incidencia de reingresos hospitalarios y la mortalidad. Sin embargo, los modelos preclínicos disponibles de sepsis no abordan el desuso del músculo esquelético, un componente clave para el desarrollo de la miopatía inducida por la sepsis. Nuestro objetivo en este protocolo es proporcionar una guía paso a paso para un modelo de ratón que reproduzca el entorno clínico experimentado por un paciente séptico postrado en cama. Para desarrollar este modelo se utilizaron ratones machos C57Bl/6. Los ratones se sometieron a ligadura y punción cecal (CLP) para inducir sepsis. Cuatro días después de la CLP, los ratones fueron sometidos a suspensión de las extremidades traseras (HLS) durante siete días. Los resultados se compararon con cirugías simuladas y/o animales con deambulación normal (NA). Los músculos fueron diseccionados para la mecánica muscular in vitro y evaluaciones morfológicas. El modelo da como resultado una marcada atrofia muscular y debilidad, un fenotipo similar observado en pacientes sépticos. El modelo representa una plataforma para probar posibles estrategias terapéuticas para la mitigación de la miopatía inducida por la sepsis.

Introducción

La sepsis es una afección potencialmente mortal debido a una respuesta inmunitaria hiperactiva que afecta negativamente a múltiples sistemas de órganos, lo que supone una gran carga para los sistemas de salud de todo el mundo^. Más recientemente, la mortalidad intrahospitalaria relacionada con la sepsis ha disminuido debido a la mejora del manejo de la unidad de cuidados de intensidad (UCI) ^1,2. Sin embargo, aproximadamente el 75% de los pacientes que sobreviven a la lesión séptica inicial desarrollan atrofia del músculo esquelético (p. ej., reducciones en el área de la sección transversal) y debilidad (p. ej., reducciones en la capacidad de producción de fuerza)^3,4. Este fenómeno se ha caracterizado como miopatía inducida por sepsis, muy ligada a la alteración de la actividad física y a la falta de independencia para realizar las tareas de la vida diaria, lo que lleva a una nueva hospitalización y a la mortalidad dentro de los cinco años siguientes al episodio inicial⁵.

Debido a una infección agresiva y generalizada, los pacientes sépticos están expuestos a períodos prolongados de reposo en cama mientras se recuperan en la UCI. En este contexto, el músculo esquelético sufre un severo desuso, lo que probablemente exacerba la atrofia muscular y la debilidad ^3,4. En la actualidad, ningún tratamiento ha abordado eficazmente la miopatía inducida por la sepsis. Los modelos preclínicos disponibles diseñados para abordar la miopatía han utilizado la ligadura y punción cecal (CLP)⁶, la suspensión cecal⁷ o la inyección de lipopolisacárido purificado (LPS), que es un componente de la pared celular en las bacterias gramnegativas⁸. A pesar de que estos modelos logran administrar la infección, no reproducen adecuadamente el desuso muscular observado en los huéspedes sépticos más allá de una reducción natural de la actividad física observada en los animales sépticos⁹.

El objetivo principal de este estudio es proporcionar una descripción detallada de cómo ejecutar correctamente el modelo de miopatía inducida por sepsis en desuso en ratones. Demostramos la factibilidad de combinar CLP como modelo de sepsis con suspensión de extremidades posteriores (HLS) como modelo de desuso para estudiar la miopatía inducida por sepsis en ratones³. Además, también se proporcionan resultados representativos de la mecánica muscular y los cambios morfológicos típicos en respuesta al modelo.

Protocolo

Los procedimientos han sido revisados y aprobados por la Universidad de Florida IACUC (#202200000227). Para el presente estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6J, de 17 semanas de edad, con una masa corporal que osciló entre 27 g y 34 g. Los procedimientos experimentales y el cronograma descritos en este protocolo se describen en la Figura 1. Como se ha indicado, el protocolo abarca un total de 11 días. Los animales se someten a una cirugía de supervivencia (CLP/Sham) el día 0, seguida de cuatro días de soporte con líquidos y analgésicos. El día 4, los animales comienzan la HLS por una duración de 7 días. Los experimentos terminales se llevan a cabo el día 11. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Ligadura y punción cecal (CLP)

1. Después de obtener los animales de la fuente comercial, deje que se aclimaten en el animalario durante al menos 1 semana antes de realizar cirugías CLP (o simuladas). Esto ayudará a minimizar el estrés asociado con el transporte.
2. Aloje a los ratones en grupo, adhiriéndose a las pautas locales de IACUC.
   NOTA: Como indicación general, los animales se alojan en un máximo de 5 ratones por jaula hasta el día de la cirugía. Las jaulas estándar, que miden 7.25 pulgadas de ancho, 11.75 pulgadas de largo y 5 pulgadas de alto, se utilizan y están amuebladas con lecho de mazorca de maíz. Se mantiene un ciclo de luz-oscuridad de 12h: 12h, con las luces encendidas a las 7 AM y apagadas a las 7 PM. La temperatura de la carcasa se mantiene entre 20 y 22 °C y la humedad relativa (HR) se mantiene entre el 30% y el 60%. Se garantiza el acceso ad libitum a la dieta estándar de chow y al agua.
3. Para realizar CLP, anestesiar al animal con isoflurano (2,5%, 500 mL/min) en una cámara de inducción. Confirme la anestesia pellizcando la pata con unas pinzas. Una vez bajo anestesia profunda, confirmada por la ausencia de retirada refleja del pellizco de las patas, transferir al animal a anestesia continua utilizando un cono nasal (2,5%, 100-125 mL/min).
   NOTA: Se deben emplear técnicas asépticas durante todo el procedimiento.
4. Aplique un ungüento lubricante ocular veterinario para proteger los ojos del animal de posibles daños o lesiones inducidos por el cono de la nariz durante la cirugía.
5. Para limpiar el sitio quirúrgico, use un removedor de vello disponible en el mercado. Retire el pelaje de la parte inferior del abdomen solamente, evitando la sobreexposición de la piel.
   NOTA: Alternativamente, se pueden usar cortadoras de pelo de animales, pero se debe tener cuidado para evitar daños en la piel.
6. Una vez que el sitio quirúrgico esté expuesto, limpie el área con tres aplicaciones de povidona yodada (o un exfoliante germicida equivalente), seguidas de un enjuague con alcohol al 70% entre cada aplicación.
7. Administrar una dosis única de 3,25 mg/kg de buprenorfina de liberación sostenida o equivalente, de acuerdo con el tratamiento analgésico aprobado por la IACUC local.
8. Transfiera el ratón al área quirúrgica. Aísle el sitio quirúrgico con un paño adhesivo. Bajo anestesia profunda, haga una incisión ventral en la línea media (~2 cm) en la piel con una hoja de bisturí.
   1. Use tijeras para separar la piel de la capa muscular. Con la hoja del bisturí, haga una incisión más pequeña (~1 cm) en la capa muscular. Una vez visualizados los intestinos, mediante fórceps romos, localizar el ciego y exteriorizarlo.
9. Una vez exteriorizado, ligar el ciego con una sutura estéril absorbible de poliglactina 5-0. Considere el área del ciego ligado, definida como la distancia desde el extremo distal del ciego hasta el punto de ligadura, ya que contribuirá a la gravedad de la infección. Para reproducir los resultados presentados aquí, ate el ciego a 1 cm de su punto distal.
   NOTA: La ligadura de un área de ciego más grande resultará en un aumento de la gravedad¹⁰.
10. Con una aguja de 27 G, perfore el ciego de principio a fin, permitiendo que el contenido fecal se filtre. Con precaución, apriete suavemente el ciego para exteriorizar el contenido fecal. Para realizar una cirugía simulada, siga los mismos pasos exponiendo el ciego del animal. Sin embargo, no ligar ni perforar el ciego.
    NOTA: El calibre de la aguja afecta directamente la gravedad de la infección. Para producir una infección de bajo grado, se recomiendan agujas de 26 g a 28 g. Tenga en cuenta que el uso de calibres de aguja más gruesos dará como resultado una mayor tasa de mortalidad, y es posible que los animales no toleren la fase posterior de suspensión de las extremidades traseras del protocolo.
11. Reubica el ciego en la cavidad abdominal. Cierre la capa muscular con una sutura reabsorbible estéril 5-0. Cierre la piel con una sutura de nylon 5-0 no absorbible. Una vez completada la sutura cutánea, proporcione solución salina estéril (1 ml para los machos y 0,5 mL para las hembras) mediante inyección subcutánea en el dorso del animal.
    NOTA: Para el cierre de la capa muscular, se recomienda una técnica de sutura continua, mientras que para la capa de piel, se recomienda una técnica de sutura interrumpida. Consulte y cumpla con las pautas locales de la IACUC para la sutura en la cirugía de supervivencia.
12. Después de la cirugía, aloje a los animales en una jaula limpia encima de un colchón calefactor o una almohadilla térmica colocada a 35 °C. Observe al ratón cada 15 minutos durante la primera hora después de la recuperación de la anestesia, después de lo cual puede ser devuelto al centro de alojamiento.
    NOTA: Proporcione una cantidad mínima de comida en el piso de la jaula para permitir que los animales coman ad libitum sin afectar el sitio quirúrgico. Después de regresar a la instalación, los animales se revisan dos veces al día después de la evaluación séptica del animal (paso 3).
13. Proporcionar solución salina estéril y soporte analgésico durante los siguientes cuatro días para permitir que la incisión quirúrgica cicatrice.
    NOTA: El control diario de la temperatura superficial y el peso corporal del xifoides ayuda a mantener registros precisos de^{la gravedad de} la sepsis.

2. Suspensión de las extremidades traseras (HLS)

1. Para realizar el HLS, los investigadores deben seguir las pautas éticas locales de la IACUC. Esto incluye garantizar el uso de las dimensiones y el suelo adecuados de la jaula, que son aspectos cruciales para acomodar los hábitos de locomoción, alimentación y bebida de los animales en condiciones de HLS.
   NOTA: Se recomiendan 4 días de recuperación después de CLP para la cicatrización de heridas.
2. Después de 4 días de recuperación de CLP o cirugía simulada, anestesiar al animal bajo un flujo ligero de isoflurano (2,5%, 100-125 mL/min). Sujeta la cola del ratón a una cadena metálica corta con cinta de espuma. Coloque la cadena de metal paralela a la cola mientras la cinta de espuma abraza firmemente la cola y la cadena.
3. Para asegurar la suspensión de las extremidades traseras, sujete la cadena de metal a un gancho conectado a una barra transversal a lo largo del centro de la jaula. Además, coloque una segunda barra pequeña que pueda moverse a lo largo del travesaño para permitir una mayor capacidad de movimiento del animal.
   NOTA: Los animales deben poder moverse a través de sus extremidades delanteras utilizando la rejilla metálica en el piso de la jaula.
4. Ajuste la altura de las extremidades suspendidas para evitar el contacto de las patas con los gránulos de chow. Vigile a los animales y limpie la zona afeitada alrededor de la piel suturada a mano con un bastoncillo de algodón empapado en agua al menos dos veces al día durante el período de suspensión.
   NOTA: La limpieza es crucial para evitar infecciones en el sitio de la cirugía, especialmente por escaldaduras de orina debido a la posición elevada del cuerpo.
5. Para reproducir los resultados, asegúrese de que los animales se sometan a 7 días de suspensión de las extremidades traseras. La duración se determinó con base en estudios previos de curso de tiempo que mostraron el tiempo mínimo requerido para que la suspensión de las extremidades posteriores provocara efectos significativos sobre los músculos esqueléticos en condiciones no sépticas^12,13.
   NOTA: La supervivencia, el malestar o la angustia de los animales aumentarán según la gravedad de la infección.

3. Evaluación de animales sépticos

NOTA: La evaluación de la condición clínica del animal es un aspecto clave para realizar un seguimiento de la gravedad después de las cirugías CLP/simuladas. Además, según lo requerido por la IACUC, se deben establecer criterios de valoración humanitarios para el bienestar animal. Para abordar estas preocupaciones y proporcionar estándares para el cuidado diario de los animales, se utilizaron instrucciones para realizar la evaluación de los animales utilizando la Puntuación de Sepsis Murina Modificada (MMSS)¹⁴.

1. Utilice el MMSS (Archivo Suplementario 1) para evaluar al animal. Tenga en cuenta que para cada categoría, una puntuación de 0 representa un animal sano. Puntúe al animal dos veces al día de 0 a 3 según la gravedad de la infección.
2. Para mejorar la precisión, mida la temperatura de la superficie xifoides y el peso corporal dos veces al día^11,15 y regístrelo junto con la hoja de puntuación del MMSS.
   NOTA: La temperatura superficial típica del xifoides y las fluctuaciones del peso corporal se proporcionan en la Figura complementaria 1.
3. Consulte a la IACUC local para conocer los puntos de conexión humanitarios.
   NOTA: Para reproducir los resultados, se utilizaron los siguientes criterios como criterios de valoración: (1) Pérdida de peso corporal >40% desde el inicio. (2) Temperatura <30 °C o reducción de >5 °C con respecto al valor anterior. (3) Una puntuación de 3 en lo siguiente: Respuesta al estímulo, nivel de conciencia o calidad de la respiración. (4) MSSS diario total ≥17. La evaluación descrita aquí está diseñada para ser realizada después de la cirugía y en animales sometidos a una deambulación normal. Se recomienda abstenerse de manipular animales sometidos a HLS para evitar el contacto entre sus extremidades traseras y superficies. Después de la evaluación final, eutanasiar al animal según las recomendaciones del comité local de ética animal.

Resultados

Para los datos representativos mostrados en los resultados, se utilizaron ratones machos C57BL/6J, de 17 semanas de edad, con una masa corporal que osciló entre 27 y 34 g. El protocolo completo tiene una duración de once días y consta de la intervención quirúrgica (CLP o simulada), el soporte salino y analgésico (días 0 a 4) y el desuso del HLS (días 4 a 11). Los experimentos terminales se pueden realizar en cualquier punto de la fase de suspensión. Para comprender mejor el impa...

Discusión

El protocolo actual proporciona directrices técnicas para la implementación de un nuevo modelo preclínico de miopatía inducida por sepsis. Todos los materiales y pasos importantes se describen en detalle para la reproducción del modelo. Este enfoque puede reproducir la disfunción del músculo esquelético observada en los pacientes sépticos, destacando el papel del desuso como un componente crucial en el empeoramiento de la miopatía. Hasta el momento, la mayoría de los estudios ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
4-0 Ethicon Coated Vicryl	Ethicon	D5792	Absorbable suture used for closure of muscle layer and for ligation of the cecum.
4-0 Ethilon Black 18"	Ethicon	662G	Non absorbable suture for closure of the skin layer.
BD  PrecisionGlide Needle 26-28 G	BD	305136 for 27g needle	Needle for puncturing the cecum.
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory	strain #000664
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	Swabs for topical application of iodine.
Cryostat	(Leica CM1950)
Dynarex Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415	Topical Antiseptic Liquid for Skin and Mucosa
Ethanol 200 Proof (100%)	Fisher Scientific		To make 70% ethanol for cleaning skin.
Hindlimb Suspension Cages	Custom Made	N/A	These custom made cages will be highlighted in the video recordings of the MS.
Optixcare Eye Lube	Optixcare		Eye lube for protection during survival surgery.
Scalpel blades #11	Fine Science		Blade used to make incisions on skin and muscle.
Skin-Trac	Zimmer	736579	Foam tape for fixing the tail to the suspension apparatus.
SomnoSuite Low-Flow Digital Vaporizer	Kent Scientific Corporation	SS-01	Vaporizer for Isoflurane Anesthesia
Tissue bath apparatus	Aurora Scientific	Model 800A, Dual Mode Muscle Lever 300C