Aislamiento de células endoteliales pancreáticas de ratón

Resumen

Este protocolo describe el aislamiento de células endoteliales de ratón de páncreas completo.

Resumen

El páncreas es un órgano vital para mantener el equilibrio metabólico dentro del cuerpo, en parte debido a su producción de hormonas metabólicas como la insulina y el glucagón, así como enzimas digestivas. El páncreas también es un órgano altamente vascularizado, una característica facilitada por la intrincada red de capilares pancreáticos. Esta extensa red capilar está formada por células endoteliales (CE) altamente fenestradas, importantes para el desarrollo y la función del páncreas. En consecuencia, la disfunción de las CE puede contribuir a la del páncreas en enfermedades como la diabetes y el cáncer. Por lo tanto, la investigación de la función de las CE pancreáticas (ECp) es importante no solo para comprender la biología del páncreas, sino también para desarrollar sus patologías. Los modelos de ratón son herramientas valiosas para estudiar las enfermedades metabólicas y cardiovasculares. Sin embargo, no ha habido un protocolo establecido con suficientes detalles para el aislamiento de las CEp de ratón debido a la población relativamente pequeña de CE y a las abundantes enzimas digestivas potencialmente liberadas por el tejido acinar que pueden provocar daño celular y, por lo tanto, un bajo rendimiento. Para hacer frente a estos desafíos, ideamos un protocolo para enriquecer y recuperar las pEC de ratón, combinando una disociación física y química suave y una selección mediada por anticuerpos. El protocolo presentado aquí proporciona un método robusto para extraer CE intactas y viables de todo el páncreas de ratón. Este protocolo es adecuado para múltiples ensayos posteriores y se puede aplicar a varios modelos de ratón.

Introducción

El páncreas, clave para el control metabólico y la homeostasis, es un órgano altamente vascularizado. El páncreas tiene funciones endocrinas y exocrinas, controlando la regulación de la glucosa en sangre y las enzimas digestivas, respectivamente. Estos dos compartimentos están unidos entre sí por una extensa red de vasos sanguíneos pancreáticos, lo que facilita el intercambio y el transporte de oxígeno, hormonas y enzimas. De manera crítica, esta densa red capilar penetra en el islote de Langerhans, un grupo de células reguladoras de hormonas dentro del páncreas responsables de su función endocrina, que consiste en las células alfa (α) secretoras de glucagón, las células beta (β) secretoras de insulina y las células delta (δ) secretoras de somatostatina ^1,2. Aunque los islotes solo representan el 1-2% de la masa pancreática, reciben el 20% del flujo sanguíneo total³, lo que destaca la importancia de la vasculatura de los islotes. Los capilares pancreáticos están formados principalmente por células endoteliales (CE) altamente fenestradas, que están rodeadas de pericitos murales. Estas CE capilares desempeñan un papel vital en el desarrollo, la maduración y la (dis)función de los islotes y forman intercomedias íntimas con varias células endocrinas y exocrinas⁴ (Figura 1).

La disfunción endotelial se ha observado tanto en la diabetes tipo 1 como en la tipo 2, las afecciones más comunes causadas por la disfunción de los islotes pancreáticos ^5,6. Tanto la densidad microvascular como la morfología de los islotes pueden estar alteradas en la diabetes⁷. Por otra parte, el cáncer de páncreas, un tumor altamente agresivo que también puede manifestarse como diabetes, se caracteriza por una alta densidad microvascular con mala perfusión⁸. Dado el papel estructural y funcional fundamental de las CE tanto en el tejido pancreático normal como en el enfermo, existe una necesidad pertinente de estudiar las CEp en el desarrollo, la fisiología y la patología para desvelar los mecanismos que impulsan la salud o las enfermedades.

Se han desarrollado numerosos protocolos para el aislamiento de CE de diferentes pacientes murinos (p. ej., cerebro ^9,10, pulmón¹¹, corazón¹², hígado¹³, músculos esqueléticos¹⁴ y tejidos adiposos¹⁵) y humanos (p. ej., cerebro¹⁶, tejido adiposo visceral^17,18, nervios periféricos¹⁹, pulmón 20,21,22 y arteria mesentérica²³) tejidos. Estos protocolos suelen implicar el uso de digestiones enzimáticas (por ejemplo, mediante colagenasa, tripsina²⁴, dispasa ^24,25 y liberasa²⁶), seguidas de una etapa de enriquecimiento basada en anticuerpos. Además, estos protocolos tienden a basarse en digestiones prolongadas en altas concentraciones de enzimas con agitación vigorosa a 37 °C (Tabla 1). Debido a las características únicas del páncreas, incluido el hecho de que alberga una gran cantidad de enzimas digestivas endógenas, estos protocolos existentes no se pueden aplicar directamente para aislar las pEC. En primer lugar, la composición de la matriz extracelular (MEC) del páncreas es diferente a la de otros tejidos. Si bien la colagenasa se usa comúnmente para el aislamiento de EC, existen múltiples subtipos con diferentes capacidades de disociación específicas de tejidos, por lo que requieren optimización. En segundo lugar, y crucial para el aislamiento de pEC, la liberación y activación de enzimas endógenas pancreáticas puede dificultar significativamente el proceso de aislamiento. Con este fin, se debe tener precaución para minimizar la ruptura de las células acinares exocrinas (la fuente principal de zimógenos, proteasas y ARNasa²⁷), lo que puede inducir un mayor daño celular y resultar en una baja viabilidad celular y afectar la recuperación general 27,28,29.

Para hacer frente a estos desafíos, hemos adaptado los métodos de los protocolos de aislamiento de CE existentes y hemos establecido un nuevo protocolo adecuado para el aislamiento de CE de páncreas de ratón. En concreto, describimos aquí un flujo de trabajo (Figura 2) que utiliza colagenasa tipo I (normalmente implementada para el aislamiento de la CE pulmonar), temperaturas de digestión más bajas y sin agitación (para evitar la activación de los zimógenos pancreáticos) y suplementación con DNasa 30,31,32 (para prevenir la apoptosis inducida por el ADN y mejorar la viabilidad celular, y un anticuerpo para CD31³³ (PECAM1, un marcador pan-EC). El protocolo descrito produce poblaciones de EC aisladas del páncreas de ratón que se pueden utilizar para la elaboración de perfiles de expresión génica y ensayos de proteínas.

Protocolo

El aislamiento de los tejidos se realizó bajo el protocolo de estudio aprobado #17010 por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Beckman Research Institute, City of Hope (Duarte, California, EE. UU.). Aquí, usamos Tie-2CreERT2; Línea de ratones Rosa26-TdTomato en fondo C57BL/6 a las 8 - 12 semanas de edad. En esta línea, las CE se marcan con TdTomato cuando se inducen con tamoxifeno como se ha descrito anteriormente³⁴. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar a todas las edades de ratones adultos con diferentes genotipos y antecedentes genéticos.

1. Recogida de tejidos (tiempo estimado: 1-2 h)

NOTA: El tiempo estimado es de 15 min/animal, se recomienda un máximo de 3 animales agrupados por muestras de disociación.

1. Eutanasia de animales por sobredosis de dióxido de carbono (CO₂), seguida de confirmación secundaria de la muerte. Antes de la disección, rocíe todo el cuerpo con etanol (EtOH) al 70%, desinfectando completamente el área de operación.
2. Estire y asegure las extremidades con alfileres. Con unas tijeras quirúrgicas, haga una pequeña incisión en la línea media a través de la piel y el peritoneo, comenzando desde la parte inferior del abdomen y extendiéndose hacia la región torácica.
3. Exponga la caja torácica cortando a través del diafragma y levante la caja torácica para exponer el corazón.
4. Inserte una aguja (25G-30G) conectada a una jeringa que contenga PBS estéril helado en el ventrículo izquierdo del corazón.
5. Inicie la perfusión inyectando el PBS a través del corazón a una frecuencia de 5 a 10 mL/min. Deténgase después de inyectar 10 mL, o hasta que el hígado y los riñones se decoloren.
6. Después de la perfusión, localice el páncreas (debajo del estómago y unido al duodeno)³⁵ (Figura 3A) y retírelo cuidadosamente con tijeras de disección y fórceps.
7. Una vez aislado, transfiera el páncreas a un tubo de 50 mL que contenga 10 mL de PBS helado + 0,2 mg/mL de inhibidor de tripsina, manténgalo en hielo (Figura 3B).
   NOTA: El páncreas de un máximo de 3 ratones se puede agrupar en este paso y transferir a 1 tubo. Las muestras se pueden mantener en hielo durante un tiempo máximo de 2 h.

2. Preparación de la colagenasa (tiempo estimado: 15-30 min)

1. Prepare las soluciones y los tampones como se describe a continuación.
   1. Solución de disociación: Añadir colagenasa tipo I en un tubo de 50 mL hasta una concentración final de 1 mg/mL en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS 1x (Ca²⁺, Mg²⁺; ver Tabla de Materiales) y 0,001 U/mL de DNasa I + 0,2 mg/mL de inhibidor de tripsina.
   2. Solución de parada de disociación: Añadir solución salina tamponada con fosfato (PBS 1x, sin Ca²⁺, Mg²⁺; lo mismo para el resto de PBS en este protocolo; ver Tabla de Materiales), 5% Albúmina Suero Bovina (BSA), 0,001 U/mL DNasa I o DMEM + 10% FBS + 0,001 MU/mL DNasa I.
   3. Tampón de lavado: Añadir PBS 1x, 0,5% de albúmina sérica bovina (BSA), 0,001 U/mL de DNasa I + 0,05 mg/mL de inhibidor de tripsina.
2. Disuelva completamente los tampones y filtre a través de un filtro de 0,22 μm. Dejar a un lado y mantener en hielo.

3. Digestión (tiempo estimado: 40 min-1 h)

1. Retire el páncreas del PBS helado y colóquelo en una placa de Petri sobre hielo. Retire cuidadosamente el exceso de tejido (p. ej., bazo, grasa, desechos) con tijeras quirúrgicas y pinzas (Figura 3C).
   NOTA: Es crucial eliminar la grasa, ya que el exceso de lípidos puede interferir con la digestión de los tejidos.
2. Transfiera el páncreas de ratón recortado a un tubo de 5 ml que contenga 1 ml de solución de disociación.
3. Mantenga el tubo en hielo y pique los tejidos pancreáticos con unas tijeras de disección en trozos finos pipeteables, por ejemplo, de 0,5 mm o 1 mm. Transfiera el lisado a un tubo de 50 ml y manténgalo en hielo.
4. Agregue páncreas adicional al tubo de 5 ml utilizado para picar inicialmente el tejido pancreático y agregue 1 ml adicional de colagenasa. Repita según sea necesario para múltiples preparaciones de páncreas.
5. Agregue 2 mL de solución de colagenasa al tubo de 5 mL para eliminar cualquier tejido pancreático residual y transfiéralo a un tubo de 50 mL. El volumen total de colagenasa debe ser de 5 mL para 3 páncreas o de 3 mL para un solo páncreas.
6. Una vez que todas las muestras hayan sido sometidas a disociación mecánica, transfiera los tubos de 50 mL que contienen los lisados de tejido homogeneizados a un baño de agua a 37 °C e incube durante 10 min.
   NOTA: No agite o agite vigorosamente la mezcla de tejidos durante este proceso, ya que esto puede causar la ruptura de los tejidos acinares y la liberación de abundantes enzimas endógenas y ADN.
7. Retire los tubos del baño de agua y revuelva suavemente para mezclar bien, y déjelos en baño de agua durante otros 10 min. (Tiempo total: 20 min).
   NOTA: No exceda los 30 minutos en un baño de agua a 37 °C para evitar la digestión excesiva.
8. Coloque los tubos en hielo y deje que el homogeneizado se asiente por gravedad. Una vez sedimentado, transfiera el sobrenadante a través de un filtro de 70 μm y agregue 5 mL de solución de parada de disociación.
9. Agregue 1 mL adicional de solución de disociación al pellet restante y triture con una aguja de 18G.
10. Pasar el homogeneizado restante a través del filtro y lavar con 5 mL adicionales de solución de parada de disociación.
11. Suspensión de célula de centrifugado a 300 x g durante 10 min, a 4 °C. Elimine el sobrenadante por completo por aspiración y mantenga la célula en hielo.
12. Vuelva a suspender el pellet celular con 1 mL de tampón de lavado y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
13. Tome una pequeña alícuota del pellet de células resuspendidas (10 μL) y mézclelo con azul de tripán en una proporción de 1:1 para contar las células con un contador de células y medir la viabilidad.

4. Enriquecimiento de células endoteliales (CE) (tiempo estimado: 2-3 h)

1. Añadir 1 μL de anticuerpo anti-CD31-biotina por cada 1 x 10⁷ células contadas e incubar durante 30 min a 4 °C en un rotador (aproximadamente 5 μL por 3 páncreas).
2. Añadir 20 μL de microesferas antibiotina e incubar durante 40 min a 4 °C en un rotador de tubo.
3. Coloque un soporte magnético con el soporte del separador de columna y aplique la columna. Equilibrar la columna con 3 mL de tampón de lavado.
4. Agregue la muestra a la columna y lave con un total de 9 ml de tampón de lavado.
   NOTA: Si la concentración de células es alta, diluya las células con 2 ml adicionales de tampón de lavado en un tubo separado. Agregue 1 ml de muestra a la vez en la columna para evitar que la columna se obstruya.
5. Retire la columna del soporte de columna y colóquela en un tubo de 15 ml. Agregue 5 mL de tampón de lavado a la columna. Utilice el émbolo para empujar hacia abajo las células de la columna y recoger la elución (que contiene EC enriquecida).
6. Centrifugar el flujo de paso y la fracción de elución/EC a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Cuente las células y mida la viabilidad como en el paso 3.13.
7. Valide el enriquecimiento de CE a través de qPCR de fracciones de flujo continuo y CE. Utilice NK6 Homeobox 1 (Nkx6.1) como marcador general para las células endocrinas y la molécula de adhesión de plaquetas y células endoteliales (Pecam1) como marcador para la EC³³. Utilice 36B4 (Rplp0, fosfoproteína ribosómica ácida p0) como control interno para la normalización de la expresión génica.
   NOTA: Las muestras recolectadas se pueden utilizar para análisis de proteínas o ARN en este paso.

5. Cultivo de pECs

1. Prepare el medio M199. Suplemento M199 medio a una concentración final de 20% de suero fetal bovino (FBS) y 0,1% de penicilina-estreptomicina.
2. Cubrir una placa de cultivo celular de 60 mm con colágeno tipo I (1 mg/ml en ácido acético 0,1 M) y dejar reposar durante 30 min a temperatura ambiente.
3. Retire el colágeno tipo I y enjuague la placa con 1X PBS, dos veces. Añada 2 mL de medio M199 preparado y coloque la placa de cultivo celular en una incubadora de cultivo celular estándar (5% CO₂, 37 °C) durante 5 min.
4. Una vez que se hayan aislado las células, agregue las células aisladas a la placa de cultivo celular M199 precalentada. Mantenga las células en condiciones de cultivo durante aproximadamente 14 días y cambie el medio cada 2-3 días.

Resultados

Siguiendo este protocolo, se pueden obtener aproximadamente 2 x 10⁶ células vivas al agrupar 3 páncreas de ratón y 750.000 células de un solo páncreas de ratón. Para validar el enriquecimiento de CE, realizamos los siguientes análisis: 1) PCR cuantitativa: en comparación con las muestras de flujo continuo (FT) (es decir, las fracciones no unidas al anticuerpo CD31), las fracciones de CE tenían niveles significativamente más altos de Pecam1 (que codifica CD31...

Discusión

En este artículo se presenta un protocolo para el enriquecimiento y aislamiento de las pECs. Al igual que los protocolos anteriores de aislamiento de CE de otros tejidos u órganos, este protocolo consta de tres procesos principales, a saber, disociación física, digestión enzimática y enriquecimiento de CE basado en anticuerpos. Para abordar los desafíos únicos en el procesamiento del páncreas, introdujimos varias adaptaciones clave y pasos críticos dentro de nuestro protocolo: ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL eppendorf	USA Scientific	1615-5500
10 cm dish	Genesee Scientific	25-202
25G needles	BD	305145
2X Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix	Vazyme	Q712-03-AA
5 mL eppendorf	Thermo Fisher	14282300
6-well plate	Greiner Bio-One	07-000-208
70 µm strainer	Fisher	22-363-548
Anti-CD31-biotin	Miltenyi Biotech	REA784
Bovine serum albumin heat shock treated	Fisher	BP1600-100
CaCl2	Fisher	BP510
Centrifuge	Eppendorf
Collagen Type 1, from calf skin	Sigma Aldrich	C9791	Attachment reagent in the protocol
Collagenase Type 1	Worthington Bio	LS004197
Countess Automatic Cell Counter	Thermo Fisher
DAPI	Thermo Fisher	D1306	immunofluorescence
Disposable Safety Scalpels	Myco Instrumentation	6008TR-10
DNAse I	Roche	260913
D-PBS (Ca2+,Mg2+)	Thermo Fisher	14080055
Ethanol	Fisher	BP2818-4
Fetal bovine serum	Fisher	10437028
Incubator			Kept at 37 °C 5% CO2
LS Columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
M199	Sigma	M2520-1L
MACS MultiStand with the QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech	130-042-303
Medium 199	Sigma Aldrich	M2520-10X
Microbeads anti-biotin	Miltenyi Biotech	130-090-485
Microscope	Leica		To assess cell morphology
Molecular Grade Water	Corning	46-000-CM
NaCl	Fisher	S271-1
New Brunswick Innova 44/44R Orbital shaker	Eppendorf
PECAM1 (CD31) Antibody	Abcam	ab56299	immunofluorescence
PECAM1 (CD31) Antibody	R&D Systems	AF3628
Phosphate Buffered Saline (10X) (no Ca2+,no Mg2+)	Genesee Scientific	25-507-XB
Primer 36B4 Forward mouse	IDT		AGATTCGGGATATGCTGTTGGC
Primer 36B4 Revese mouse	IDT		TCGGGTCCTAGACCAGTGTTC
Primer Kdr Forward mouse	IDT		TCCAGAATCCTCTTCCATGC
Primer Kdr Reverse mouse	IDT		AAACCTCCTGCAAGCAAATG
Primer Nkx6.1 Reverse mouse	IDT		CACGGCGGACTCTGCATCACTC
Primer Nxk6.1 Forward mouse	IDT		CTCTACTTTAGCCCCAGCG
Primer PECAM1 Forward mouse	IDT		ACGCTGGTGCTCTATGCAAG
Primer PECAM1 Reverse mouse	IDT		TCAGTTGCTGCCCATTCATCA
RNase ZAP	Thermo Fisher	AM9780
RNase-free water	Takara	RR036B
Sterile 12" long forceps	F.S.T	91100-16
Sterile fine forceps	F.S.T	11050-10
Sterile fine scissors	F.S.T	14061-11
Tissue Culture Dishes 2cm	Genesee Scientific	25-260
TRIzol reagent	Fisher	15596018
Trypan Blue	Corning	MT25900CI
Trypsin Inhibitor	Roche	10109886001
Tween-20
VE-Cadherin Antibody	Abcam	ab33168	immunofluorescence
Waterbath