Toma de muestras de sangre y medición hormonal para determinar la etapa del ciclo ovárico en titíes

Resumen

Este protocolo describe la toma de muestras de sangre y orina para medir los niveles de progesterona/estradiol y gonadotropina coriónica para determinar la etapa del ciclo ovárico. Los niveles hormonales se utilizan para predecir y determinar el momento de la ovulación y se inyectan hormonas para regular el ciclo ovárico y el crecimiento de los ovocitos.

Resumen

Los titíes comunes son pequeños monos del Nuevo Mundo. Dado que muchos de sus mecanismos biológicos son similares a los de los humanos, los titíes son potencialmente útiles para la investigación médica y de biología humana en una variedad de campos, como la neurociencia, la medicina regenerativa y el desarrollo. Sin embargo, hay una falta de literatura que describa los métodos para muchos experimentos y procedimientos básicos. Aquí se describen métodos detallados para determinar los niveles de hormonas sexuales (progesterona, estradiol y gonadotropina coriónica) en titíes. La medición de estas hormonas permite predecir el estadio del ciclo ovárico, que suele ser de 26 a 30 días en los titíes; La determinación precisa es esencial para la recolección de ovocitos/cigotos en el momento correcto y para la preparación de las hembras hospedadoras para la generación de titíes modificados genéticamente.

Además, la medición de los niveles de hormonas sexuales es útil para estudios de endocrinología, etología, desarrollo temprano y biología reproductiva. Este protocolo proporciona una descripción detallada de los métodos para la toma de muestras de sangre de la vena femoral, la separación del plasma para la medición de hormonas, la medición de los niveles de gonadotropina coriónica utilizando orina y plasma, el restablecimiento del ciclo ovárico mediante inyecciones de un análogo de prostaglandina F2α para acortar y sincronizar el ciclo, y la promoción del crecimiento folicular y la ovulación mediante la inyección de hormona foliculoestimulante y gonadotropina coriónica. Utilizando estos protocolos, se pueden determinar las etapas del ciclo ovárico para la recolección oportuna de ovocitos/cigotos.

Introducción

El tití común (Callithrix jacchus) es un pequeño mono del Nuevo Mundo con muchas características similares a las de los humanos, y la duración de su ciclo ovárico es de 26-30 días ^1,2. Los estudios sobre el desarrollo temprano y la generación de titíes modificados genéticamente requieren la recolección de ovocitos y cigotos en etapas específicas del ciclo ovárico. Por lo tanto, la determinación precisa del estadio es crucial y puede estimarse midiendo los niveles sanguíneos de las hormonas progesterona (P4) y estradiol (E2)^2,3. Estas hormonas promueven el crecimiento del endometrio, que es necesario para la implantación. La P4 se produce a partir del cuerpo lúteo, que se forma en los ovarios inmediatamente después de la ovulación. El E2 es secretado por los folículos ováricos en respuesta a la hormona foliculoestimulante (FSH) del complejo hipotálamo-hipófisis en el cerebro. Los niveles de E2 aumentan a medida que el folículo madura, alcanzando su punto máximo antes de la ovulación³. Los niveles altos de E2 causan la liberación pulsada de la hormona luteinizante (LH) a través del complejo hipotálamo-hipófisis en los seres humanos; este aumento de LH induce la ovulación. Sin embargo, en los titíes, el gen LH sufrió degeneración durante la evolución, y la ovulación es inducida por la liberación de gonadotropina coriónica (CG), que tiene una estructura similar a la de LH, de la glándula pituitaria ^4,5.

El ciclo ovárico se puede controlar mediante inyecciones de hormonas. Las inyecciones de FSH, en humanos, actúan sobre los receptores ováricos de FSH y se utilizan para promover la síntesis de estrógenos y el crecimiento de^folículos. La inyección de CG humana (hCG) como sustituto de la LH al final de la fase folicular se utiliza para estimular la ovulación en humanos⁷. Las inyecciones de CG también se usan para tratar la infertilidad humana porque CG estimula el cuerpo lúteo al principio del embarazo, lo que resulta en una mayor producción de P4. Las inyecciones de prostaglandina F2α (PGF2α) restablecen el ciclo ovárico⁸. En el ganado doméstico, la inyección de PGF2α se utiliza para acortar la fase lútea y sincronizar el ciclo estral para el manejo reproductivo.

Aunque los titíes y los seres humanos tienen mecanismos biológicos similares, lo que los convierte en animales modelo ideales, hay una falta de literatura que describa los métodos básicos para muchas técnicas de uso frecuente. La toma de muestras de sangre es una de las técnicas más utilizadas 9,10,11,12. Sin embargo, los principiantes a veces tienen problemas para encontrar la vena. Por lo tanto, este estudio realizó análisis anatómicos de la región de la vena femoral. Con base en observaciones anatómicas, este protocolo presenta la región proximal del triángulo femoral como un sitio fácil para la venopunción.

Protocolo

Todos los métodos que involucran titíes utilizan altos estándares éticos y de bienestar y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Nacional para la Salud y el Desarrollo Infantil. Los animales utilizados en este lugar fueron de un solo alojamiento o de parejas (una hembra y un macho) con 12 h de luz al día.

1. Toma de muestras de sangre de la vena femoral

1. Prepare una jeringa de 1 ml (el tipo corto es fácil de usar) con una aguja de 25 g con la hoja hacia arriba. Para evitar la obstrucción de la sangre, heparinice la jeringa extrayendo 200 μL de solución de heparina sódica sin diluir en la jeringa. Cubra el interior de la jeringa de manera uniforme tirando de ella hacia arriba y hacia abajo varias veces; Luego, expulse la solución de heparina de la jeringa.
   NOTA: Dado que a menudo es necesario cambiar a una jeringa nueva, prepare algunas jeringas heparinizadas adicionales.
2. Prepare hisopos absorbentes de algodón y alcohol. Encienda una lámpara ajustable para iluminar el área donde se colocará el tití para la toma de muestras de sangre.
3. Prepare el dispositivo de sujeción (420 x 85 x 85 mm, Figura 1A), que está disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles). Para colocar un tití en el dispositivo, abra la parte de retención con el cinturón de esponja, que asegura los titíes. Inserte el tití en el dispositivo de retención boca arriba.
   NOTA: Los titíes suelen estar tranquilos con dispositivos de sujeción, lo que puede negar la necesidad de aclimatación o entrenamiento de restricción.
4. Captura al tití; inserte el tití en la parte cilíndrica; y asegúrelo presionando hacia abajo el cinturón de esponja. Coloque la pierna de la que se va a recoger la sangre encima de la otra (Figura 1A). Sostenga las piernas con la mano no dominante; Coloque los dedos medio y anular dentro de cada pierna para sujetarlos y los otros dedos fuera de cada pierna para fijarlos.
   NOTA: Se recomiendan guantes de mordida cuando se capturan titíes. Si no hay un dispositivo de sujeción, realice la recolección de sangre bajo anestesia o con otra persona que sujete al tití.
5. Compruebe si la vena femoral es visible cerca de la base del muslo. Si no es así, palpa para encontrar la arteria pulsante y utilízala como punto de referencia para comprobar que la vena pasa por su interior (Figura 1B-D).
   NOTA: Se recomienda la iluminación del escritorio y el afeitado del cabello para mejorar la visibilidad. La visibilidad también se puede mejorar frotando con hisopos con alcohol. Los ganglios linfáticos en el triángulo a menudo se encuentran cerca de la vena y muestran un color azul oscuro como una vena. La forma de distinguirlos se describe en la sección Resultados representativos.
6. Desinfecte el sitio de la punción con un hisopo con alcohol. Inserte la aguja con la hoja hacia arriba en un ángulo de 15°-20°. Para evitar que la aguja se salga del vaso sanguíneo durante la extracción de sangre, estabilice la mano que sostiene la jeringa, por ejemplo, apoyándola en la otra mano.
7. Tire suavemente hacia atrás del émbolo para aplicar presión negativa (Figura 1E). Empuje la punta de la aguja hacia adelante. Una vez que la sangre entra en la jeringa, mantenga la posición de la punta de la aguja hasta que se haya recogido el volumen requerido (500-700 μL).
   1. Cuando la sangre no entra en la jeringa, cambie el sitio de la punción. Si la sangre sale al sacar la aguja, detenga el sangrado aplicando presión en el sitio de la punción durante 3 minutos. Después de detener el sangrado, reinicie la venopunción.
   2. Si la sangre que se extrae en la jeringa deja de fluir durante el proceso de extracción, empuje lentamente la punta de la aguja hacia adelante y luego tire de ella hacia atrás para encontrar el vaso sanguíneo. Esto puede restaurar el flujo de sangre hacia la jeringa. De lo contrario, saque la aguja y realice la venopunción con una jeringa nueva.
      NOTA: Use el muslo de la otra pierna cuando sea difícil recolectar sangre del mismo lado.
8. Tire con cuidado de la aguja mientras presiona ligeramente el sitio de la punción con el dedo meñique. Luego, con un hisopo de algodón absorbente, aplique presión inmediatamente en el sitio de punción durante 3 minutos para detener el sangrado. Invierta la jeringa para mezclar la sangre y la heparina.
   NOTA: Aplique presión durante más tiempo (5 min) mientras se enfría cuando se extraiga sangre arterial, y confirme cuidadosamente el cese del sangrado para prevenir la formación de hematoma, que a veces puede resultar en un resultado fatal.
9. Después de confirmar que el sangrado ha cesado, retire el cinturón de esponja, sostenga la cintura del animal con una mano y gírelo para que uno pueda sostener la axila del animal con la otra mano desde la parte trasera.
10. Regresa el tití a su jaula. Para reducir el estrés y facilitar la toma repetida de muestras de sangre, proporcione al tití su comida favorita (por ejemplo, galletas, malvaviscos o bizcocho). Comprobar la aparición de hematomas de vez en cuando.
    NOTA: Cuando el hematoma se encuentra en la etapa temprana, aplique un vendaje de presión para prevenir la progresión del hematoma. Cuando se encuentra después de mucho tiempo, puede ser necesaria la extirpación quirúrgica del hematoma con ligadura de la arteria femoral y transfusión de sangre ^9,13.
11. Separe la aguja de la jeringa para prevenir la hemólisis. A continuación, expulse lentamente la sangre recogida a lo largo de la pared interior de un microtubo de 1,5 ml.
    NOTA: La sangre recolectada puede almacenarse a 4 ^oC durante un máximo de 24 horas antes de la separación del plasma para medir los niveles de P4/E2.

2. Separación del plasma y determinación de los niveles hormonales

1. Centrifugar la sangre en un tubo de 1,5 mL a 1.100 × g durante 5 min a 4 ^oC.
2. Transfiera el plasma separado (sobrenadante) del tubo de 1,5 mL a un nuevo tubo/taza, evitando cuidadosamente la inclusión de células sanguíneas (sedimento).
3. Mida los niveles de P4 y E2 utilizando un kit ELISA o un analizador automático. Si la cantidad de plasma no es suficiente para el analizador automático, utilice una solución de dilución de muestra.
   NOTA: Para la medición con un analizador automático, se requieren >175 μL de plasma para determinar solo un nivel de P4, y >250 μL de plasma para determinar tanto P4 como E2.

3. Medición de CG en orina para detectar la ovulación y el embarazo

NOTA: Los niveles de CG en los titíes se pueden medir utilizando una prueba de kit inmunocromatográfico tanto para la ovulación como para el embarazo. En el caso de la ovulación, se puede obtener un resultado positivo 0-2 días antes de la ovulación. En el caso del embarazo, se detecta un resultado positivo desde los días 15-20 hasta aproximadamente el día 100 de embarazo. La prueba requiere una pequeña cantidad (90 μL) de orina (una gota de orina es ~30 μL).

1. Método de la bandeja: Si hay más de dos animales en la misma jaula, mueva el tití objetivo (o los otros animales) a otra jaula el día anterior. Coloque una bandeja limpia en el fondo de la jaula la noche anterior o anterior al encendido. La orina no se drena de la vejiga durante la noche. Por lo tanto, la orina generalmente se libera de la vejiga poco después de la iluminación.
   NOTA: Entrar en la habitación por la mañana antes de la iluminación puede interrumpir el ciclo de sueño de la cohorte. Por lo general, la orina se puede recolectar aproximadamente 30 minutos después de la iluminación.
2. Método de exprimido: Prepare las bandejas lavadas para la recolección de orina. Después de ubicar la vejiga del tití, apriétela con cuidado desde el frente y ambos lados usando toda la longitud de los dedos (Figura 1F). Recoja la orina justo antes de iluminar la habitación por la mañana.
   NOTA: Si la recolección de orina no tiene éxito debido a la ausencia de orina en la vejiga, espere un momento y vuelva a intentarlo. Tenga cuidado de no usar fuerza excesiva porque esto lastimará al animal.
3. Inmediatamente después de la recolección, coloque la muestra de orina en el pocillo del kit de prueba inmunocromatográfica. Lea el resultado después de 10 minutos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

4. Control y determinación de la etapa del ciclo ovárico para la recolección de ovocitos, cigotos y embriones

1. Recolección de ovocitos de vesículas germinales (GV) de los ovarios
   1. Administrar una inyección intramuscular de 3 μL de 0,263 mg/mL de cloprostenol (un análogo sintético de PGF2α) diluido en 150 μL de solución salina¹⁴ (Figura 2) para restablecer el ciclo ovárico al final de la fase lútea (es decir, ≥10 días después del inicio de la fase lútea).
      NOTA: Puede ser conveniente preparar la solución diluida en un volumen mayor, ya que el cloprostenol diluido se mantiene estable durante, al menos, varias semanas a +4 °C.
   2. Al día siguiente (día 1), confirme el inicio de la fase folicular comprobando que el nivel de P4 ha bajado.
      NOTA: Se ha reportado que la inyección de cloprostenol disminuye drásticamente los niveles de P4 (generalmente <10 ng/mL) dentro de las 24 h³.
   3. A partir del día 1, inyecte FSH (25 UI, intramuscular) una vez cada 2 días durante un total de 5 veces (días 1, 3, 5, 7 y 9). El día 10, inyecte hCG (75 UI, intramuscular) por la tarde.
   4. Recoger los GVs de los ovarios en el día 11 por aspiración folicular bajo anestesia según la literatura^15,16.
      NOTA: A veces, la ovulación ocurre antes de lo esperado. Por lo tanto, se recomienda controlar los niveles de CG a partir del día 8. Si la prueba de GC es positiva, realice la recolección de GV ese día.
2. Recolección de ovocitos de metafase II (MII), cigotos y embriones tempranos
   1. Restablezca el ciclo ovárico con cloprostenol como se describe en el paso 4.1.1.
   2. Al día siguiente (día 1), confirme el inicio de la fase folicular comprobando que el nivel de P4 ha bajado.
   3. Para la recolección de cigotos y embriones, aloje a los titíes hembra junto con los titíes machos para el apareamiento a partir del día 6.
   4. A partir del día 7, controle los niveles de P4/E2 en sangre y los niveles de CG en orina de las hembras. La detección de CG es una indicación de ovulación dentro de unos pocos días (generalmente al día siguiente). El día en que los niveles de P4 aumentan y los niveles de E2 disminuyen en comparación con el día anterior, se recogen ovocitos MII o cigotos embrionarios de día 0 (E0) de los oviductos^17,18.
   5. Para la recolección de embriones, tal como se describe en la literatura, se debe realizar el lavado desde los oviductos (E1-E3, 1-8 células)^17,18 o desde el útero (E5-E10, 8 células-blastocisto)19,20,21,22 en el momento adecuado, dependiendo de la etapa objetivo.

Resultados

Los detalles relacionados con los animales utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1.

Análisis anatómicos de la vena femoral
Se realizaron análisis anatómicos de la vena femoral con un tití común macho de 2 años de edad (I 7713M) sometido a eutanasia. Las venas y arterias femorales se encuentran en el triángulo femoral. El triángulo femoral se forma en los límites entre la pared abdominal y los músculo...

Discusión

La localización de la vena es el paso más crítico en la recolección de sangre. Sobre la base de las observaciones anatómicas, este protocolo presenta el área proximal en el triángulo femoral como un sitio fácil para la recolección de sangre en titíes. Usando esta área, se puede realizar fácilmente una muestra de sangre de una vena grande. Sin embargo, incluso usando este protocolo, a veces se producen lesiones en una arteria. Cuando se lesiona una arteria, se sugiere detener ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
AIA-360	Tosoh Corporation	0019945	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK DILUENT CONCENTRATE	Tosoh Corporation	0020956	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK SUBSTRATE SET II	Tosoh Corporation	0020968	Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK WASH CONCENTRATE	Tosoh Corporation	0020955	Hormone measurement (P4/E2)
CMS-1	CLEA Japan		Marmoset food
Estrumate	MSD Animal Health		PGF2alpha analog (cloprostenol)
Gonal-f Subcutaneous Injection 150	Merck Biopharma Co., Ltd.		FSH
Gonatropin for intramuscular injection 1000	ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.	872413	hCG
Heparin sodium injection solution 5,000 units/5 mL	Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.	224122458	Blood collection
Immunochromatographic Test Kit for Detection of Common Marmoset Chorionic Gonadotropin (Dual Checker)	CLEA Japan, Inc.		Determining CG level
Low-profile double-arm microscope illumination LPF-SD	SHIOKAZE GIKEN		Desk lamp for blood collection
Marmoset blood collection restraint device	JIC Japan	JM-1006	Blood collection http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html email: vi@jic-japan.jp
Metacam 0.05%	Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd.		Hematoma treatment
Sample Cup, 3 mL, PS, for Tosoh 360 and AIA-600 II, 1000/Bag	Globe Scientific	110913	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2	Tosoh Corporation	0025224	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 CALIBRATOR SET	Tosoh Corporation	0025324	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 SAMPLE DILUTING SOLUTION	Tosoh Corporation	0025524	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII	Tosoh Corporation	0025240	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII CALIBRATOR SET	Tosoh Corporation	0025340	Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE DILUTING SOLUTION	Tosoh Corporation	0025540	Hormone measurement (P4/E2)
Syringe with 25 G (0.50 x 25 mm) needle	TERUMO	SS-01T2525	Blood collection
Tensolvet 5.000 I.E. gel.	Dechra Pharmaceuticals	14033492	Hematoma treatment
TOSOH MULTI-CONTROL SET	Tosoh Corporation	0015965	Hormone measurement (P4/E2)