Un enfoque eficiente de transgénesis para la entrega de genes en el corazón embrionario de ratón

Resumen

Este protocolo presenta un marco metodológico detallado para la transgénesis de células cardíacas basada en electroporación en corazones de ratón en desarrollo. Los recursos de video que se proporcionan aquí facilitarán el aprendizaje de esta técnica versátil.

Resumen

El corazón de los mamíferos es un órgano complejo que se forma durante el desarrollo a través de poblaciones muy diversas de células progenitoras. El origen, el momento del reclutamiento y el destino de estos progenitores son vitales para el correcto desarrollo de este órgano. Los mecanismos moleculares que gobiernan la morfogénesis del corazón son esenciales para comprender la patogenia de las cardiopatías congénitas y la regeneración cardíaca embrionaria. Los enfoques clásicos para investigar estos mecanismos emplearon la generación de ratones transgénicos para evaluar la función de genes específicos durante el desarrollo cardíaco. Sin embargo, la transgénesis del ratón es un proceso complejo y lento que a menudo no se puede realizar para evaluar el papel de genes específicos durante el desarrollo del corazón. Para abordar esto, hemos desarrollado un protocolo para la electroporación eficiente y el cultivo de corazones embrionarios de ratón, lo que permite que la transgénesis transitoria evalúe rápidamente el efecto de la ganancia o pérdida de función de los genes involucrados en el desarrollo cardíaco. Utilizando esta metodología, sobreexpresamos con éxito Meis1 en el corazón embrionario, con preferencia por la transfección de células epicárdicas, demostrando las capacidades de la técnica.

Introducción

El corazón es el primer órgano que se forma durante el desarrollo embrionario. Este proceso implica la coordinación espacio-temporal de varias poblaciones de células progenitoras de distintas áreas del embrión. Todo esto ocurre mientras el corazón en desarrollo continúa latiendo y funcionando, enfatizando la notable coordinación requerida para su formación ^1,2,3. Dado el papel crucial del corazón, una regulación estricta a nivel celular y molecular es esencial para su correcta formación ^4,5. La identificación de los m....

Protocolo

Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Ética de Experimentación Animal del CNIC y se ajustaron a la legislación vigente, incluida la Directiva de la UE 2010/63EU y la Recomendación 2007/526/CE, tal y como se aplica en la legislación española en virtud del Real Decreto 53/2013. Para este protocolo, se emplearon ratones hembra CD-1 de tipo salvaje de 15 a 21 semanas de edad. Los detalles sobre los animales, los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de plásmidos y herramientas

1. En primer lugar, prepare la mezcla de electr....

Discusión

En general, la metodología descrita aquí ofrece un marco robusto para expresar constructos transgénicos en el epicardio en desarrollo (Figura 4B), como lo demuestra la sobreexpresión de Meis1 (Figura 4C). Con los constructos apropiados, este protocolo se puede utilizar para evaluar transitoriamente el impacto de la ganancia de función (GOF) o la pérdida de función (LOF) de un gen específico. El LOF se puede implementar en la técnica mediante la transfec.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
#55 Forceps	Dumont	11295-51
12-well Clear Flat Bottom Multiwell Cell Culture Plate	BD Falcon	353043
35 mm vise table	Grandado	SKU 8798771617573
40 µm Cell Strainer	Fischer Scientific	08-771-1
50 mL tubes	BD Falcon	352070
70 µm Cell Strainer	Corning	CLS431751
Anti-GFP Policlonal Antibody	Invitrogen	A10262	1:1000 dilution used
Anti-Myosin 4 (MF20) Monoclonal Antibody	Invitrogen	14-6503-82	1:500 dilution used
CD1 Wild Type mice			Provided by Animalary Unit (CNIC)
Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody	Cell Signalling Technologies	9661	1:400 dilution used
DAPI	Cell Signalling Technologies	4083	1:1000 dilution used
Dispase/collagenase	Roche	10269638001
Distilled water
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	10313021
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10438-026
Heracell 150i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51032720
Leica Stereoscopic Microscope S8AP0	Leica	11524102
Liberase	Roche	5401119001
Micropipette Puller Model P-97	Sutter Instrument	SU-P-97
pCAG expression plasmid	Addgene	#89689
Penicillin-streptomycin	Invitrogen	15070-063
Petri dishes 35 × 10 mm	BD Falcon	351008
Petri dishes 60 × 15 mm	BD Falcon	353002
Phenol Red	Merck	P3532
Pipette tips			Reused from old laboratory equipment
Rat Serum culture embryo, male rats SPRAGUE DAWLEY RjHan SD	Janvier Labs	9979
Recombinant anti-Wilms Tumor Protein 1 (WT1) Antibody	Abcam	ab89901	1:300 dilution used
Square Wave Electroporator CUY21SC	Nepa Gene	CUY664-10X15
Sterile PBS			Provided and autoclaved by technical unit
Sucrose	Millipore	84100
Tweezer electrodes with variable gap	Nepa Gene	CUY650P5