Explorando el músculo Longissimus: Desentrañando su correlación con la calidad de la carne en Bos indicus y toros cruzados

Resumen

Investigamos el tejido muscular esquelético en Bos indicus y toros cruzados para explicar las diferencias en los rasgos de calidad de la carne. Se encontró que la fuerza de corte de Warner-Bratzler (WBSF) oscilaba entre 4,7 kg y 4,2 kg. Las isoformas de cadena pesada de miosina revelaron diferencias entre los animales, y el índice de fragmentación de miofibrillas proporcionó más información sobre las variaciones de sensibilidad (WBSF).

Resumen

Este estudio investigó el tejido muscular en Bos indicus y toros cruzados para explicar las diferencias en los rasgos de calidad de la carne. Se describen las características de la canal, los parámetros de calidad de la carne y las investigaciones bioquímicas y moleculares de las proteínas miofibrilares. Se han descrito métodos para evaluar el pH, la grasa intramuscular (IMF), el color de la carne (L*, a*, b*), las pérdidas de agua, la terneza y los ensayos de biología molecular. Se describen los procedimientos específicos que detallan la calibración, la preparación de la muestra y el análisis de datos para cada método. Estas incluyen técnicas como la espectroscopia infrarroja para el contenido de IMF, la evaluación objetiva de la terneza y la separación electroforética de las isoformas de MyHC.

Los parámetros de color se destacaron como herramientas potenciales para predecir la terneza de la carne de res, un rasgo de calidad crucial que influye en las decisiones de los consumidores. En el estudio se empleó el método de fuerza cortante de Warner-Bratzler (WBSF), revelando valores de 4,68 y 4,23 kg para Nellore y Angus-Nellore (P < 0,01), respectivamente. Las pérdidas totales de cocción y los análisis bioquímicos, incluido el índice de fragmentación de miofibrillas (MFI), proporcionaron información sobre las variaciones de terneza. Se investigaron los tipos de fibras musculares, en particular las isoformas de cadena pesada de miosina (MyHC), con una notable ausencia de la isoforma MyHC-IIb en los animales cebú estudiados. La relación entre MyHC-I y la terneza de la carne reveló hallazgos divergentes en la literatura, lo que pone de manifiesto la complejidad de esta asociación. En general, el estudio proporciona una visión completa de los factores que influyen en la calidad de la carne en toros Bos indicus y cruzados (Bos taurus × Bos indicus), ofreciendo información valiosa para la industria de la carne de vacuno.

Introducción

Brasil tiene el mayor hato ganadero comercial del mundo, con aproximadamente 220 millones de animales y se ubica como el segundo mayor productor de carne, con una producción de más de 9 millones de toneladas métricas de canal equivalentes al año¹. El sector de producción de ganado vacuno contribuye significativamente al sistema agropecuario nacional, con ventas anuales totales que superan los R$ 55 mil millones. Desde 2004, Brasil ha sido un actor clave en el comercio mundial de carne, exportando a más de 180 países, lo que representa ~50% del comercio mundial de carne².

La terneza de la carne se destaca como el atributo de calidad primordial que influye en la satisfacción del consumidor y el consumo de carne³. Mediante el empleo de métodos bioquímicos y objetivos para medir la ternura de la carne, los investigadores pretenden proporcionar información valiosa sobre factores como la genética animal, las técnicas de procesamiento y las condiciones de almacenamiento, mejorando en última instancia la calidad y la consistencia de los productos cárnicos para los consumidores. Esta información es útil porque la ternura de la carne ha cobrado cada vez más importancia en la toma de decisiones de los consumidores durante las compras. Además, la evaluación de la terneza de la carne proporciona información valiosa para el control de calidad en las industrias de producción y procesamiento de carne. Al monitorear constantemente la terneza, los productores pueden asegurarse de que los productos cárnicos cumplan con los estándares y especificaciones deseados. En este contexto, los productores brasileños de ganado vacuno de carne están adoptando progresivamente sistemas intensivos de engorde con animales cruzados para mejorar la rotación de capital. Este sistema representa alrededor del 10% de las toneladas de canal producidas anualmente en Brasil ^4,5.

La creciente demanda de una mejor calidad de la carne por parte de los consumidores ha llevado a los productores de ganado vacuno a cruzarse con razas europeas, principalmente Aberdeen Angus⁶. Esta estrategia tiene como objetivo producir híbridos F1 Angus-Nellore, conocidos por su rendimiento superior, características de canal deseables y mejor calidad de la carne en comparación con los animales cebú puros ^7,8. En las regiones tropicales de Brasil, es una práctica común utilizar animales no castrados (toros) de madurez avanzada en las granjas de engorde, lo que puede comprometer los atributos de calidad de la carne, como el color, el marmoleado y la terneza. Cabe destacar que una encuesta revela que el 95% de los animales terminados en los feedlots brasileños son machos, siendo el 73% Nellore, seguido por el 22% de los animales mestizos y el 5% de otros genotipos ^9,10.

Comprender los mecanismos bioquímicos que subyacen a la ternura de la carne es crucial para mejorar la calidad de la carne. Un aspecto clave es la proteólisis postmortem, que afecta la integridad estructural de las fibras musculares¹¹. El índice de fragmentación de miofibrillas (MFI) es un ensayo bioquímico ampliamente utilizado que cuantifica el grado de degradación de las miofibrillas, proporcionando información sobre la terneza de la carne¹². El método MFI consiste en medir la fragmentación de las proteínas miofibrilares, que se correlaciona directamente con la ternura de la carne. Este ensayo complementa las evaluaciones tradicionales de la calidad de la carne y ofrece una comprensión más profunda de los procesos bioquímicos que contribuyen a las variaciones en la ternura de la carne.

En este contexto, el presente estudio investigó el músculo esquelético de toros Bos indicus versus mestizos (Bos taurus × Bos indicus) terminados en feedlot, con el objetivo de explicar las diferencias en los rasgos de calidad de la carne.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales cumplieron con las normas éticas de investigación establecidas por el Comité de Ética en Uso de Animales (CEUA) de la Universidad Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - UNESP Campus Botucatu, bajo el protocolo 0171/2018.

1. Animales de experimentación

1. Terminar 30 toros Nellore (Bos indicus) y 30 toros F1 Angus-Nellore (Bos taurus × Bos indicus), de 20 a 24 meses, en un corral de engorde. Alojar a ambos grupos de animales en corrales colectivos de 5 m x 6 m con suelo de hormigón y equipados con bebederos tipo concha, con capacidad para hasta cinco animales por corral. Asegúrese de que todos los animales pertenezcan al mismo grupo de manejo (nacidos y criados en la misma granja) y se presenten al mismo período de engorde.
   NOTA: En este estudio, los toros Nellore tuvieron un peso corporal inicial promedio de 370,7 kg, mientras que los toros F1 Angus-Nellore tuvieron un peso corporal inicial promedio de 380,8 ± 17 kg.
2. Dieta de los corrales de engorde
   1. Asegúrese de que la dieta de engorde esté compuesta por un 11,3 % de forraje (heno Tifton y bagazo de caña de azúcar) y un 88,7 % de concentrados (grano de maíz seco molido, harina de soja, granos húmedos de destilería de maíz, alimento seco con gluten de maíz y núcleo mineral). Alimentar a los animales durante 120 días y proporcionar las dietas ad libitum dos veces al día (a las 10:00 a.m. y a las 04:00 p.m.).
3. Matanza
   1. Registre el peso corporal final (PC) al final del período experimental. Procese todos los animales en un matadero cercano, siguiendo los procedimientos de inspección estándar. Antes del sacrificio, asegúrese de que los animales se sometan a un ayuno mínimo de 16 horas, absteniéndose tanto de alimento como de agua.
      NOTA: Los toros F1 Angus-Nellore exhibieron un peso corporal final de 615.09 ± 57.53 kg, mientras que los toros Nellore tuvieron un peso de 545.47 ± 11.45 kg.
4. Evaluación de las características de la canal
   1. Pesar inicialmente las canales de vacuno y luego someterlas a un período de enfriamiento a 2-4 °C durante 48 h. Las mediciones incluyen el peso de la canal caliente (HCW), el área del ojo de costilla (REA) y el grosor de la grasa dorsal (BFT) en la interfaz de^{la costilla} 12^/ 13, como se recomienda¹³. Determine el REA utilizando el método de cuadrícula con una cuadrícula pequeña (18 cm x 13 cm) y mida el BFT en milímetros con un calibrador.
      1. Mida el REA en cada canal utilizando una cuadrícula reticulada (la misma que se usa en el sistema de clasificación de grado de rendimiento del USDA), dividida en cuadrados de 1 cm² con un punto en el medio. Suma todos los cuadrados dentro del perímetro de trazado del chuletón y los que están a lo largo del contorno del trazo pasando por el punto central.
      2. Mida el BFT en una posición específica en el sitio de evaluación, en cualquier lugar entre las costillas 12^o 13^. Para determinar esta posición, mida la longitud del ojo de bife; luego, comenzando en el borde medial "A", determine un punto a tres cuartos del camino a lo largo del rib eye y a mitad de camino a través de "B". Tome una pinza a través de este punto y en ángulo recto con la costilla especificada hasta la interfaz entre la grasa subcutánea y la grasa intermuscular. Mida la grasa subcutánea colocando el calibrador en ángulo recto con respecto a la línea de la grasa subcutánea, desde el punto de interfaz (Figura suplementaria S1).
5. Muestreo
   1. Muestrear Longissimus thoracis (LT) de la media canal izquierda (porción de ± 12,0 cm de carne), entre las costillas^11ª y^13ª en dirección craneal. En el laboratorio, corte las muestras de carne en filetes de 2,54 cm.
6. Envejecimiento
   1. Evaluar las características de calidad de la carne después de un período de maduración húmeda de 14 días a una temperatura de 0-2 °C en una incubadora de demanda biológica de oxígeno (DBO). Utilice filetes de 2,54 cm de grosor para el análisis del color de la carne, el pH, la grasa intramuscular, la pérdida de purga, la capacidad de retención de agua, la terneza objetiva y las pérdidas de cocción. Empaque los filetes por separado en bolsas de plástico para alto vacío y baja permeabilidad al oxígeno y, una vez alcanzado el tiempo de maduración, manténgalos congelados a -20 °C hasta el momento del análisis. Descongelar las muestras de carne de vacuno a 4 °C durante 24 h y exponerlas al oxígeno durante 30 min a 4 °C (tiempo de floración).

2. pH de la carne

1. Mida el pH de la carne utilizando un medidor de pH digital equipado con una sonda de penetración. Calibrar con tampones de pH 4.0 y 7.0 a una temperatura ambiente de 25 °C. Mida el pH de la carne en tres ubicaciones de la muestra de músculo LT. Registre manualmente las lecturas de datos y posteriormente exporte la hoja de datos; calcule el promedio de las tres lecturas para el pH de la carne.

3. Grasa intramuscular

NOTA: El contenido de grasa intramuscular (IMF) se determinó mediante espectroscopía de infrarrojo cercano (NIR)¹⁴ y por método gravimétrico¹⁵.

1. Retire la grasa subcutánea del músculo LT con un bisturí. A continuación, triturar y homogeneizar el filete durante 5 min con ayuda de una batidora, incorporando aproximadamente 180 g de la muestra. Coloque la muestra en una taza, colóquela dentro de la cámara de muestras y realice un subescaneo de varias zonas de la muestra de prueba girando la taza de muestra; Fusiona las zonas para obtener el resultado final.
2. Tome tres lecturas para cada muestra. Después de la homogeneización, coloque las muestras en la placa para su posterior lectura. Configure el aparato en transmisión NIR, con un monocromador de rejilla móvil que escanea la región de 850 nm a 1050 nm.
3. Exporte la hoja de datos y luego calcule el promedio de tres lecturas para el FMI. Exprese los resultados como un porcentaje, utilizando la fórmula: [(promedio del FMI ÷ peso de la muestra) × 100].
4. Combine homogeneizar las muestras de músculo LT (3,0 g) con una solución de cloroformo/metanol metanol/cloroformo (2:1) durante 2 min y someterlas a centrifugación (700 × g; 10 min; 20 °C) para segregar las fases hidrofílica (superior), sólida (media) e hidrofóbica (inferior).
5. Filtrar la fase hidrofóbica obtenida después de la centrifugación utilizando un papel de filtro en un embudo con ligera succión. Transfiera el filtrado (fase inferior; lípidos en cloroformo) a un matraz etiquetado como fase lipídica y transfiera al menos 5 mm de filtrado a un matraz de precipitados prepesado después de dejarlo reposar durante unos minutos. A continuación, registre el volumen de la capa de cloroformo (al menos 150 mL) y aspire la capa alcohólica.
   1. Homogeneizar 100 g de alícuotas de la muestra de tejido fresco o congelado durante 2 min con una mezcla de 100 mL de cloroformo y 200 mL de metanol. Agregue 100 ml de cloroformo a la mezcla, mezcle durante 30 s, agregue 100 ml de agua destilada y mezcle durante otros 30 s.
   2. Filtrar el homogeneizado a través de papel de filtro en un embudo con ligera succión. Aplique presión con el fondo de un vaso de precipitados cuando el residuo se seque para garantizar la máxima recuperación del disolvente.
   3. Transfiera el filtrado a un cilindro graduado de 500 mL y déjelo reposar durante unos minutos para permitir la separación y la clarificación. Registre el volumen de la capa de cloroformo (al menos 150 mL) y aspire la capa alcohólica.
   4. Asegúrese de quitar completamente la capa superior; La capa de cloroformo contiene el lípido purificado. Para la extracción cuantitativa de lípidos, recupere el lípido atrapado en el residuo tisular mezclando el residuo y el papel de filtro con 100 mL de cloroformo.
   5. Filtre la mezcla a través del embudo y enjuague la jarra de la batidora y los residuos con un total de 50 mL de cloroformo. Mezcle este filtrado con el filtrado original antes de eliminar la capa alcohólica.
      NOTA: La filtración suele ser rápida; Aplique presión con el fondo de un vaso de precipitados sobre el residuo seco para garantizar la máxima recuperación del disolvente.
6. Secar las muestras en un horno, enfriarlas en un desecador durante al menos 24 h, colocarlas en un horno a 110 °C hasta la evaporación completa del disolvente, enfriarlas aún más en un desecador durante la noche y, finalmente, volver a pesarlas.
7. Determine el contenido de IMF calculando la diferencia entre el peso inicial y el peso final del vaso de precipitados.

4. Color de la carne

1. Calibre el dispositivo utilizando una placa estándar blanca y otra negra. Coloque la placa de calibración blanca cerca del centro de la placa. Al realizar una calibración, use el área cerca del centro de la placa. La calibración se completa después de que la lámpara parpadee tres veces.
2. Realice las mediciones después de 30 min a 4 °C (tiempo de floración). Obtenga lecturas de color de tres ubicaciones diferentes en la muestra de músculo LT, evitando cuidadosamente el tejido conectivo y la grasa.
3. A temperatura ambiente (20 °C), calcule un promedio a partir de estas mediciones, como se recomienda¹⁶.

5. Pérdidas de agua

1. Evalúe la pérdida de purga (PL) de todas las muestras. Determine el PL de las secciones de lomo de res midiendo la variación entre el peso inicial antes de la congelación y el peso final después de la congelación/descongelación.
   NOTA: No evalúe el PL de los lomos de res de control nunca congelados.
2. Medir la capacidad de retención de agua (WHC) por la diferencia de peso de una muestra de carne (aproximadamente 1,0 g) antes y después de ser sometida a una presión de 10 kg durante 5 min¹⁷.

6. Ternura objetiva de la carne

NOTA: La medición de la fuerza cortante de Warner-Bratzler (WBSF) se realizó como se describe^18,19.

1. Colocar las muestras en una rejilla fijada a un refractario de vidrio y cocinarlas en un horno eléctrico industrial hasta alcanzar una temperatura final de 71 °C. Después de la cocción, enfrie, pese y refrigere las muestras a 4 °C durante 24 h.
2. Determine las pérdidas de cocción (CL) utilizando la fórmula .
   1. Determine la pérdida por goteo pesando el refractario antes y después de cocinar la muestra. Con este fin, coloque las muestras en una rejilla sobre un refractario de vidrio para permitir el drenaje de los jugos y la grasa de la carne durante la cocción.
   2. Determine la pérdida por evaporación pesando solo la muestra antes y después de la cocción.
   3. Registre los pesos crudos y cocidos y calcule el porcentaje de DL como el peso del goteo después de la cocción dividido por el peso de la muestra de carne descongelada.
   4. Calcule el porcentaje de pérdida por evaporación (PVE) utilizando la fórmula [100 - (peso después de la cocción) ÷ peso bruto × 100].
3. Para la determinación de WBSF, corte ocho núcleos con un diámetro de 1,27 cm utilizando un analizador de textura, equipado con una cuchilla Warner-Bratzler Shear Force de 3,07 mm y un filo en forma de V (ángulo de 60°).
   1. Reporte los resultados como el promedio de seis valores por muestra, en kilogramos (kg), después de excluir los extremos bajo y alto¹⁹.

7. Ensayo bioquímico

NOTA: La proteólisis post mortem se evaluó mediante la estimación del índice de fragmentación de miofibrillas (IMF), siguiendo el procedimiento original descrito por Culler et ^al.20 y adaptado para bovinos Bos indicus por Borges et ^al.21.

1. Homogeneizar fragmentos de aproximadamente 3 g de muestras de LT (tejido muscular despojado de grasa y tejido conectivo) en una solución tampón que contenga 100 mM de cloruro de potasio, 20 mM de fosfato de potasio a pH 7, 1 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), 1 mM de cloruro de magnesio y 1 mM de azida de sodio a 2 °C, seguido de centrifugación (1.000 × g durante 15 min a 4 °C).
   1. Resuspender el sedimento en 10 volúmenes (v/w) de medio aislante utilizando una varilla de agitación, luego sedimentarlo nuevamente a 1.000 × g durante 15 min y decantar el sobrenadante.
   2. Resuspender el sedimento en 2,5 volúmenes (v/w) de medio aislante y separar el tejido conectivo y los residuos pasándolo a través de un colador de polietileno (malla 18). Utilice 2,5 volúmenes adicionales (v/w) para permitir que las miofibrillas pasen a través del colador.
   3. Determinar la concentración proteica de la suspensión de miofibrillas mediante el método biuret de Gornall et ^al.22. Diluir una alícuota de la suspensión de miofibrilla con medio aislante hasta una concentración de proteína de 0,5 ± 0,05 mg/mL.
   4. Mida inmediatamente la absorbancia de esta suspensión a 540 nm. Determine MFI mediante espectrofotometría a 540 nm. Multiplique la absorbancia por 200 para obtener el MFI de cada muestra (y repórtelo como un índice sin una unidad de medida).

8. Ensayo de biología molecular

NOTA: Para el análisis de la cadena pesada de miosina (MyHC), la proteína más abundante en el músculo esquelético bovino, se procesaron muestras de LT de ambos grupos siguiendo el protocolo descrito en la literatura^23,24.

1. Logre la separación electroforética utilizando un gel SDS-PAGE degradado (7-10%) y un gel apilador al 4%. Aplique 25 μL de cada muestra al gel y hágalo funcionar a 70 V, 28 mA y 4 °C durante 1 h, seguido de una ejecución a 180 V, 12 mA y 4 °C durante 29 h.
2. Emplee dos tampones diferentes en las carreras: el tampón de gel superior que comprende glicina, base de tris(hidroximetil)aminometano, dodecil sulfato de sodio (SDS) y agua destilada, mientras que el tampón de gel inferior es idéntico al tampón superior, con la adición de mercaptoetanol.
3. Tiña los geles con Coomassie Blue y captura imágenes con el software adecuado.
4. Identifique las isoformas de MyHC (MyHC-I, MyHC-IIa, MyHC-IIx/d) en función de sus pesos moleculares (223,900, 224,243 y 223,875 kDa, respectivamente). Realizar análisis semicuantitativos por densitometría de las bandas correspondientes a cada isoforma, utilizando el software adecuado.
5. Emplee el sóleo de rata y el músculo extensor largo de los dedos (EDL) como controles positivos para clasificar las isoformas de MyHC, reservando un pocillo en cada gel para cargar 40 μL de la muestra procesada.
6. Para todos los datos, realice el análisis de varianza (ANOVA) mediante la prueba F, utilizando el siguiente modelo:
   Y_ij = μ + t_i + Ɛ_ij
   donde Yij es el valor observado de la unidad experimental referida al tratamiento i en repetición j; μ es el efecto general de la media; t es el efecto del tratamiento (grupo genético), y ε es el error experimental.
7. Compare las medias utilizando la prueba t de Student y adopte el valor P < 0,05 como probabilidad crítica.

Resultados

En la Tabla 1 se muestran los rasgos de la canal de los dos grupos genéticos investigados en este estudio. En particular, se identificaron diferencias (P < 0,01) en HCW, REA y BFT, con animales cruzados que exhibieron mayores valores, lo que sugiere un efecto de heterosis.

Variable¹

Nellore

F1 Angus x Nellore

SEM

Valor P

Discusión

Durante la evaluación de la canal, es crucial medir con precisión las características de crecimiento y calidad después de un período de enfriamiento de 48 h para obtener datos consistentes y comparables. Los dos modelos biológicos exhibieron rasgos divergentes de la canal, particularmente HCW, REA y BFT, que son consistentes con los hallazgos informados en otros estudios. El promedio de HCW de los toros Nellore se alinea con las preferencias del mercado brasileño, que prioriza una mayor producción de carne por un...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetone	Merk, Darmstadt, Germany	CAS 67-64-1 | 100014	solutions used for the electrophoretic separations
Anti-MYH-1 Antibody	Merk, Darmstadt, Germany	MABT846	Rat soleus
Anti-Myosin antibody	Abcam, Massachusetts, United States	ab37484	Myosin heavy chain
Anti-Myosin-2 (MYH2) Antibody	Merk, Darmstadt, Germany	MABT840	Extensor digitorum longus (EDL)
Biological oxygen demand (BOD) incubator	TECNAL, São Paulo, Brazil	TE-371/240L	Meat aging
Chloroform; absolute analytical reagent	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	67-66-3	Intramuscular fat
CIELab system	Konica Minolta Sensing, Tokyo, Japan	CR-400 colorimeter	Meat color
Coomassie Blue	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	C.I. 42655)	Myosin heavy chain
Electric oven	Venâncio Aires, Rio Grande do Sul, Brazil		Meat tenderness
Ethanol	Merk, Darmstadt, Germany	64-17-5	solutions used for the electrophoretic separations
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	60-00-4	Post-mortem proteolysis
Glass flasks	Sigma-Aldrich, Missouri, United States		solutions used for the electrophoretic separations
Glycine	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	G6761	Myosin heavy chain
Infrared spectroscopy - FoodScan	Foss NIRSystems, Madson, United States	FoodScan™ 2	Intramuscular fat
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	7786-30-3	Post-mortem proteolysis
Mercaptoetanol	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	M6250	Myosin heavy chain
Methanol, absolute analytical reagent	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	67-56-1	Intramuscular fat
pH meter	LineLab, São Paulo, Brazil	AKLA 71980	Meat pH
PlusOne 2-D Quant Kit	GE Healthcare Product	Code 80-6483-56	Post-mortem proteolysis
Polypropylene	Sigma-Aldrich, Missouri, United States		solutions used for the electrophoretic separations
Potassium chloride	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	7447-40-7	Post-mortem proteolysis
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	P0662	Post-mortem proteolysis
R software	Vienna, Austria	version 3.6.2	Data analysis
Sodium azide	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	26628-22-8	Post-mortem proteolysis
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	822050	Myosin heavy chain
Spectrophotometer	Perkin Elmer, Shelton, United States	Perkin Elmer Lambda 25 UV/Vis	Post-mortem proteolysis
Statistical Analysis System	SAS, Cary, North Carolina, United States	version 9.1,	Data analysis
Texture Analyzer	AMETEK Brookfield, Massachusetts, United States	CTX	Meat tenderness
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Aldrich, Missouri, United States	77-86-1	Myosin heavy chain
Ultrafreezer	Indrel Scientific, Londrina, Paraná, Brazil.	INDREL IULT 335 D - LCD	Sample storage
Ultrapure water	Elga PURELAB Ultra Ionic system	solutions used for the electrophoretic separations
Ultra-Turrax high shear mixer	Marconi – MA102/E, Piracicaba, São Paulo, Brazil		Post-mortem proteolysis