Modelado in vitro de la deposición de grasa en la enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica

Resumen

Este artículo describe el uso de células HepG2 inducidas por ácido oleico como modelo para la enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica.

Resumen

La prevalencia de la enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica (MASLD, por sus siglas en inglés) ha aumentado debido a los cambios en los patrones económicos y de estilo de vida, lo que ha provocado importantes problemas de salud. En informes anteriores se ha estudiado el establecimiento de modelos animales y celulares para MASLD, destacando las diferencias entre ellos. En este estudio, se creó un modelo celular mediante la inducción de la acumulación de grasa en MASLD. Las células HepG2 se estimularon con el ácido graso insaturado ácido oleico a varias concentraciones (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) para emular MASLD. La eficacia del modelo se evaluó mediante ensayos del kit de recuento de células-8, tinción con Oil Red O y análisis del contenido de lípidos. Este estudio tuvo como objetivo crear un modelo celular fácil de operar para las células MASLD. Los resultados de los ensayos del kit de recuento de células 8 mostraron que la supervivencia de las células HepG2 dependía de la concentración de ácido oleico, con un IG₅₀ de 1,875 mM. La viabilidad celular en los grupos de 0,5 mM y 1 mM fue significativamente menor que en el grupo control (P < 0,05). Además, la tinción de Oil Red O y el análisis del contenido de lípidos examinaron la deposición de grasa a diferentes concentraciones de ácido oleico (0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM) en células HepG2. El contenido de lípidos de los grupos de 0,25 mM, 0,5 mM y 1 mM fue significativamente mayor que el del grupo control (P < 0,05). Además, los niveles de triglicéridos en los grupos de OA fueron significativamente más altos que en el grupo control (P < 0,05).

Introducción

La enfermedad hepática esteatótica asociada a la disfunción metabólica (MASLD, por sus siglas en inglés) abarca una variedad de afecciones, que incluyen esteatosis simple, esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), cirrosis y carcinoma hepatocelular ^1,2,3,4,5,6, todas atribuidas a factores distintos al consumo de alcohol⁷. La MASLD es la enfermedad hepática más prevalente causada por lesión metabólica hepática, afectando a casi una cuarta parte de la población mundial 8,9,10,11,12. Si bien aún no se ha dilucidado la patogenia precisa de MASLD, varias teorías intentan explicar su desarrollo. Una noción predominante sugiere un alejamiento de la teoría clásica de "dos golpes" hacia un modelo de "múltiples golpes"¹. Un elemento central de estas hipótesis es el papel de la resistencia a la insulina, que se cree que es fundamental en la patogénesis de MASLD¹³. Las investigaciones indican que la resistencia a la insulina en los hepatocitos conduce a un aumento de los niveles de ácidos grasos libres, formando posteriormente triglicéridos almacenados en el hígado^14,15.

Los investigadores han utilizado modelos in vivo e in vitro para simular la deposición de grasa en MASLD; Sin embargo, replicar completamente su mecanismo patológico sigue siendo un desafío. A pesar de esta limitación, estos modelos han sido fundamentales en el estudio de posibles dianas terapéuticas para MASLD. Sin embargo, el desarrollo de un modelo estable de MASLD es crucial. Si bien los modelos animales son efectivos, requieren mucho tiempo y son costosos, lo que pone de manifiesto el creciente interés en los modelos celulares in vitro . Estos modelos suelen utilizar uno o varios ácidos grasos libres, como el ácido oleico (OA) y el ácido palmítico, para recrear el MASLD inducido por la dieta. Entre ellas, la línea celular de hepatoblastoma humano HepG2 se utiliza a menudo para establecer modelos celulares in vitro de MASLD.

La inducción de OA estimula las células HepG2 para replicar la deposición de grasa similar a MASLD, un método con una historia bien establecida. El objetivo de este estudio fue demostrar la viabilidad, la tinción de Oil Red O (ORO), el contenido de lípidos y el nivel de triglicéridos (TG) de las células HepG2 tratadas con 0,25 mM de OA. El objetivo de este experimento fue proporcionar más evidencia para el desarrollo de estudios de modelado MAFLD.

Protocolo

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, instrumentos y reactivos utilizados en este protocolo.

1. Cultivo celular

1. Cultivo de células HepG2 en matraces de cultivo que contienen el medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) (que contiene 10% de suero fetal bovino [FBS], 100 unidades/mL de penicilina y 100 μg/mL de estreptomicina). Mantener los matraces de cultivo a 37 °C en una incubadora con 5% de CO₂ .

2. Efecto del ácido oleico en la viabilidad celular medido por el kit de recuento celular-8

1. Disolver un volumen específico de OA en dimetilsulfóxido (DMSO) para lograr una concentración de 200 mM. Almacene la solución a -20 °C para su uso futuro.
2. Siembre células HepG2 en una placa de 96 pocillos con una densidad celular de 6 × 10³ celdas por pocillo. Agregue 100 μL de DMEM a cada pocillo. Incubar y cultivar las células a 37 °C en una incubadora de 5% de CO₂ durante 24 h. Divida las células HepG2 en dos grupos:
   1. Grupo de control: añadir medio de cultivo celular.
   2. Grupo OA: añadir OA al medio de cultivo celular para alcanzar concentraciones finales de 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM y 1 mM.
3. Después de 24 h de incubación inicial, desechar el sobrenadante de cada pocillo y agregar OA de acuerdo con el grupo especificado, agregando 100 μL por pocillo. Para el grupo de control, agregue 100 μL de medio de cultivo celular a cada pocillo. Continúe incubando las células durante otras 24 h.
   NOTA: Asegúrese de que cada grupo tenga seis pozos replicados. Para evitar la evaporación, agregue 100 μL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) al anillo exterior de los pocillos en la placa de 96 pocillos.
4. Después de 24 h de incubación, agregue 10 μL de kit de conteo de células-8 (CCK-8) a cada pocillo, mezcle suavemente e incube durante 2 h en la oscuridad. Retire la placa de 96 pocillos de la incubadora, colóquela en el lector de microplacas y mida el valor de absorbancia a 450 nm (A₄₅₀). Los valores de IG₅₀ se contabilizaron según el DO.

3. Tinción de aceite rojo O para observar la formación de gotas de lípidos intracelulares

1. Siembre las células HepG2 en placas de cultivo celular de 6 pocillos a una densidad de 5 × 10⁵ células por pocillo y cultive las placas en una incubadora de temperatura constante durante 24 h. Consulte la Figura 1 para obtener una representación visual de los pasos descritos.
2. Después de 24 h de cultivo celular, agregue 2 mL de medio de cultivo celular que contenga OA a cada pocillo, logrando concentraciones finales de 0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM y 1 mM. Después de 24 h adicionales, retire el medio de cultivo celular de cada pocillo y lave dos veces con PBS. Agregue 1 mL de fijador ORO a cada pocillo e incube durante 30 min.
3. Prepare la solución de tinción ORO mezclando la solución de tinción A con la solución de tinción B en una proporción de 3:2. Deje reposar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 minutos, luego filtre una vez a través de un filtro de 0,45 μm. Guarde la solución filtrada en un tubo de centrífuga protegido de la luz hasta su uso.
4. Deseche el fijador y lávese dos veces con agua destilada. Añadir 1 mL de isopropanol al 60% a cada pocillo e incubar durante 30 s. Deseche el 60% de la solución de isopropanol y agregue 1 mL de solución de tinción ORO recién preparada a cada pocillo antes de incubar durante 20 minutos. Deseche la solución de tinción ORO, agregue 1 mL de isopropanol al 60% a cada pocillo e incube durante 30 s. Lava 5 veces con agua para eliminar el exceso de tinte.
5. Cubra las células con agua destilada y observe bajo un microscopio. Una vez recogidas las imágenes, desecha el líquido de la placa y deja que se seque. A continuación, añada 2 mL de isopropanol a cada pocillo y agite el plato en un agitador orbital durante 10 min. Transfiera el líquido a una nueva placa de 96 pocillos, con 16 pocillos en cada grupo, agregando 100 μL por pocillo. Calcule el contenido de lípidos midiendo la densidad óptica (OD) de cada pocillo utilizando un lector de microplacas a 510 nm (A₅₁₀).

4. Efectos de diferentes concentraciones de ácido oleico sobre el triglicérido total en el sobrenadante celular HepG2

1. Equilibre el kit a temperatura ambiente durante 20 minutos y prepare las placas necesarias para el experimento.
2. Recoja el sobrenadante celular y centrifugue a 1.570 × g durante 10 min. Establecer pozos estándar y probar pozos de muestra. Agregue 50 μL de concentración estándar ([S0 → S5] seguida de: 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 mmol/L) a los pocillos estándar. Además de los pocillos en blanco y estándar, agregue 10 μL de muestras diferentes a los pocillos de muestra, seguido de agregar 40 μL de diluyente de muestra a cada pocillo. Añadir 100 μL de anticuerpo de detección-peroxidasa de rábano picante a cada pocillo, sellar con una membrana de placa e incubar a 37 °C durante 1 h en un horno de temperatura constante.
3. Deseche el sobrenadante, séquelo en papel sin polvo y lave cada pozo con 1 solución de lavado. Dejar reposar a temperatura ambiente durante 1 min. Repita el proceso de lavado 5 veces.
4. Agregue 50 μL de sustrato A y 50 μL de sustrato B a cada pocillo. Mezclar suavemente e incubar durante 15 min a 37 °C. Agregue 50 μL de solución de terminación a cada pocillo y mida el valor OD de cada pocillo a 450 nm (A₄₅₀) dentro de los 15 min.
5. Represente la concentración del patrón a lo largo del eje x y el valor de absorbancia (OD) correspondiente a lo largo del eje y para realizar una regresión lineal y derivar la ecuación de la curva para calcular el valor de concentración de cada muestra.

5. Análisis estadístico

1. Determinar diferencias significativas en los datos cuantitativos.
2. Calcule la media ± la desviación estándar (DE) y represente gráficamente los datos. Considere que P < 0,05 son estadísticamente significativos.

Resultados

Efecto del ácido oleico sobre la viabilidad celular
Las células HepG2 se expusieron a concentraciones variables de OA (0 mM, 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM, 1 mM), lo que resultó en una disminución en las tasas de supervivencia celular a 0,125 mM, 0,25 mM, 0,5 mM y 1 mM en comparación con 0 mM. Se observó significación estadística a 0,5 mM (P < 0,05) y 1 mM (P < 0,05) en comparación con 0 mM. Los resultados del impacto de la OA en la viabilidad celular, evaluados por el kit CCK-8...

Discusión

El MASLD es un síndrome clinicopatológico caracterizado por un depósito excesivo de grasa intracelular en los hepatocitos debido a factores más allá del alcohol y otros agentes hepáticos establecidos¹⁸. La MASLD está estrechamente relacionada con la lesión hepática por estrés metabólico adquirido, especialmente asociada con la resistencia a la insulina y la susceptibilidad genética. Para estudiar y cribar eficazmente los fármacos para detectar la MASLD, es crucial seleccionar un model...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filter	Millex
0.25% Trypsin-EDTA (1x) Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
0.45 µm filter	Millex
2 mL Crygenic Vials	CORNING	430659
25 cm2 Cell Culture Flask	CORNING	430639
6-well cell culture plate	CORNING	3516
96-well cell culture plate	CORNING	3599
Blood Count Plate	Shanghai Jing Jing Biochemical Reagent & Instrument Co.	02270113
Cell Counting Kit-8 assays	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	CA1210-1000T
CO2 incubator	NUAIRE	NU-5710E
DMSO Dimethyl sulfoxide	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	D8371
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco	8122691
Enzyme Labeling Equipment	Tecan	Spark
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	10099141
HepG2 cells line	Beijing North China Chuanglian Biotechnology Research Institute (BNCC)	221031
Human Triglyceride (TG) ELISA instruction	Nanjing Jiacheng Bioengineering Institute	20170301
Inverted Microscope for Cell Culture	Leica	DMi1
Isopropanol	Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co.	2021030141
Oil Red Stain Kit, For Cultured Cells	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd.	G1262
Oleic acid	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A502071
Penicillin Streptomycin	Gibco	15140122
SPSS 24.0		Statistics software