Métodos para permitir la transcriptómica espacial de los tejidos óseos

Resumen

En este trabajo describimos un método que permite la descalcificación de los tejidos óseos recién obtenidos y la conservación de ARN de alta calidad. También se ilustra un método para seccionar muestras de huesos no desmineralizados con formalina fija (FFPE) para obtener resultados de buena calidad si no se dispone de tejidos frescos o no se pueden recolectar.

Resumen

Comprender la relación entre las células y su ubicación dentro de cada tejido es fundamental para descubrir los procesos biológicos asociados con el desarrollo normal y la patología de la enfermedad. La transcriptómica espacial es un método potente que permite el análisis de todo el transcriptoma dentro de muestras de tejido, proporcionando así información sobre la expresión génica celular y el contexto histológico en el que residen las células. Si bien este método se ha utilizado ampliamente para muchos tejidos blandos, su aplicación para los análisis de tejidos duros como el hueso ha sido un desafío. El principal desafío reside en la incapacidad de preservar el ARN de buena calidad y la morfología del tejido mientras se procesan las muestras de tejido duro para el corte. Por lo tanto, aquí se describe un método para procesar muestras de tejido óseo recién obtenidas para generar de manera efectiva datos transcriptómicos espaciales. El método permite la descalcificación de las muestras, otorgando secciones de tejido exitosas con detalles morfológicos preservados y evitando la degradación del ARN. Además, se proporcionan directrices detalladas para las muestras que anteriormente estaban incrustadas en parafina, sin desmineralización, como las muestras recogidas de los bancos de tejidos. Con estas directrices, se muestran datos transcriptómicos espaciales de alta calidad generados a partir de muestras de bancos de tejidos de tumor primario y metástasis pulmonares de osteosarcoma óseo.

Introducción

El hueso es un tejido conectivo especializado compuesto principalmente por fibras de colágeno tipo 1 y sales inorgánicas¹. Como resultado, el hueso es increíblemente fuerte y rígido y, al mismo tiempo, ligero y resistente a los traumatismos. La gran resistencia del hueso deriva de su contenido mineral. De hecho, para cualquier aumento dado en el porcentaje de contenido de minerales, la rigidez aumenta cinco veces². En consecuencia, los investigadores se enfrentan a importantes problemas cuando analizan, mediante cortes histológicos, la biología de un espécimen óseo.

La histología ósea no desca....

Protocolo

Todos los procedimientos con animales que se describen a continuación fueron aprobados de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina Dental de la Universidad de Pittsburgh.

1. Método para preparar bloques de FFPE de muestras de tejido óseo que requieren desmineralización

1. Preparación de reactivos y materiales
   1. Prepare EDTA 20% pH 8.0. Para 1 L, disuelva 200 g de EDTA en 800 mL de agua ultrapura, ajuste el pH a 8.0 con hidróxido de sodio 10 N y finalmente lleve el volumen a 1L con agua ultrapura. Almacene a temperatura ambiente.
      NOTA: Utilice siempre ....

Discusión

Aquí, se proporciona un método detallado para preparar bloques de FFPE de huesos descalcificados y preservar la integridad del ARN para la secuenciación (es decir, secuenciación de próxima generación (NGS)) o para otras técnicas relacionadas con el ARN (es decir, hibridación in situ , reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR), etcétera).

El método utiliza EDTA para descalcificar muestras de tejido óseo; la incubación con EDTA per.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced orbital shaker	VWR	76683-470	Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.
Camel Hair Brushes	Ted Pella	11859	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Use to perform spatial transcriptomics.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Use to prepare EDTA 20% pH 8.0.
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.
High profile diamond microtome blades	CL Sturkey	D554DD	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	Sequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS  to perform tissue fixation.
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.
Premiere Tissue Floating Bath	Fisher Scientific	A84600061	Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7002	Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.
Semi-Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2245	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	S8045-500	Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Use to process sequencing data output .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small	10X Genomics	PN-1000363	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.