Transformación mitocondrial en Baker

Resumen

Este trabajo explica cómo transformar las mitocondrias de la levadura utilizando un método biolístico. También mostramos cómo seleccionar y purificar los transformantes y cómo introducir la mutación deseada en la posición objetivo dentro del genoma mitocondrial.

Resumen

La levadura de panadería Saccharomyces cerevisiae se ha utilizado ampliamente para comprender la biología mitocondrial durante décadas. Este modelo ha proporcionado conocimiento sobre las vías mitocondriales esenciales y conservadas entre los eucariotas y las vías específicas de hongos o levaduras. Una de las muchas habilidades de S. cerevisiae es la capacidad de manipular el genoma mitocondrial, que hasta ahora solo es posible en S. cerevisiae y el alga unicelular Chlamydomonas reinhardtii. La transformación biolística de las mitocondrias de levadura nos permite introducir mutaciones dirigidas al sitio, hacer reordenamientos genéticos e introducir reporteros. Estos enfoques se utilizan principalmente para comprender los mecanismos de dos procesos altamente coordinados en las mitocondrias: la traducción por mitoribosomas y el ensamblaje de complejos respiratorios y ATP sintasa. Sin embargo, la transformación mitocondrial puede utilizarse potencialmente para estudiar otras vías. En el presente trabajo, mostramos cómo transformar las mitocondrias de levadura mediante bombardeo de microproyectiles a alta velocidad, seleccionar y purificar el transformador deseado e introducir la mutación deseada en el genoma mitocondrial.

Introducción

La levadura Saccharomyces cerevisiae es un modelo ampliamente reconocido que se utiliza para estudiar la biogénesis mitocondrial. Dado que la levadura es un organismo anaeróbico y facultativo, es posible estudiar ampliamente las causas y consecuencias de la introducción de mutaciones que perjudican la respiración. Además, este organismo posee herramientas genéticas y bioquímicas amigables para estudiar las vías mitocondriales. Sin embargo, uno de los recursos más poderosos para explorar los mecanismos de ensamblaje del complejo respiratorio y la síntesis de proteínas mitocondriales es la capacidad de transformar las mitocondrias y modificar el genoma del orgá....

Protocolo

NOTA: Recomendamos realizar seis transformaciones para cada constructo, ya que la eficiencia de la transformación mitocondrial suele ser baja. La composición de los diferentes medios de crecimiento se muestra en la Tabla 2.

1. Preparación de partículas de tungsteno

1. Pesar 30 mg de partículas de tungsteno de 0,7 μm (WP, microportadores) en un microtubo. Añadir 1,5 mL de etanol al 70% (EtOH) para esterilizar. Agita los WP y déjalos reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
2. Centrifugar a 13.200 x g durante 15 min a temperatura ambiente. Lave los WP añadiendo 1,5 mL de agua ....

Discusión

El presente trabajo describe cómo transformar con éxito las mitocondrias de la levadura S. cerevisiae . El proceso, desde el bombardeo de microproyectiles a alta velocidad hasta la purificación de la cepa de levadura prevista, dura ~ 8-12 semanas, dependiendo de cuántas rondas de purificación de ^{la cepa} sintética sean necesarias. Algunos de los pasos críticos del método son los siguientes. En primer lugar, cuanto más grandes sean las regiones flanqueantes añadidas alrededor del sitio de la m.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL pipette tips	Axygen	T-1000-B
1.5 mL Microtube	Axygen	MCT-150-C
10 μL pipette tips	Axygen	T-10-C
15 mL conical bottom tube	Axygen	SCT-25ML-25-S
200 μL pipette tips	Axygen	T-200-Y
50 mL conical bottom  tube	Axygen	SCT-50ML-25-S
AfiII	New England BioLabs	R0520S
Agarose	SeaKem	50004
Analytic balance	OHAUS	ARA520
Autoclave	TOMY	ES-315
Bacto agar	BD	214010
Bacto peptone	BD	211677
Biolisitic Macrocarrier holder	BIO-RAD	1652322
Bunsen burner	VWR	89038-528
Calcium chloride	Fisher Scientific	C79-500
CSM -ADE	Formedium	DCS0049
CSM -ARG	Formedium	DCS0059
CSM -LEU	Formedium	DCS0099
CSM -URA	Formedium	DCS0169
Culture glass flask	KIMAX KIMBLE	25615
Culture glass tube	Pyrex	9820
Dextrose	BD	215520
Ethanol	JT Baker	9000
Forceps	Millipore	620006
Glass beads	Sigma	Z265926
Glass handle	Sigma	S4647
Glycerol	JT BAKER	2136-01
Helium tank grade 5 (99.99 %)	-	-
HSTaq  Kit	PCR BIO
Microcentrifugue	Eppendorf	022620100
NdeI	New England BioLabs	R0111L
Orbital shaker	New Brunswick scientific	NB-G25
PCR tubes	Axygen	PCR-02-C
PDS-1000/He TM Biolistic Particle Delivery System	BIO-RAD	165-2257
Petri dishes (100X10)	BD	252777
QIAprep Spin Miniprep	Qiagen	27106
Raffinose	Formedium	RAF03
Replica plater	Scienceware	Z363391
Rupture discs 1350 Psi	BIO-RAD	1652330
Sorbitol	Sigma	S7547
Spermidine	Sigma	S0266
T4 DNA Ligase	Thermo Scientific	EL0011
Tissue Culture Rotator	Thermo Scientific	88882015
Tungsten microcarriers M10	BIO-RAD	1652266
Vaccum pump of 100L/min capacity	-	-
Velvet pads	Bel-Art	H37848-0002
Vortex	Scientifc Industries	SI-0236
Wood aplicator stick	PROMA	1820060
Yeast extract	BD	212750
Yeast Nitrogen base without aminoacids	BD	291920