Ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para medir los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas

Resumen

Hemos establecido un ensayo de reensamblaje de luciferasa dividida para monitorear los contactos entre el retículo endoplásmico y las mitocondrias en células vivas. Con este ensayo, describimos un protocolo para medir cuantitativamente el nivel de estos acoplamientos interorgánulos en HEK293T células, bajo la condición de tratamiento químico.

Resumen

Los sitios de contacto entre el retículo endoplásmico (RE) y las mitocondrias desempeñan un papel fundamental en la salud y la homeostasis celular, como la regulación del Ca²⁺ y la homeostasis lipídica, la dinámica mitocondrial, la biogénesis de autofagosomas y mitofagosomas y la apoptosis. La falta de mantenimiento del acoplamiento normal entre el RE y la mitocondria está implicada en muchas enfermedades neurodegenerativas, como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica y la paraplejia espástica hereditaria. Es de considerable importancia explorar cómo la desregulación de los contactos ER-mitocondriales podría conducir a la muerte celular y si la reparación de estos contactos al nivel normal podría mejorar las condiciones neurodegenerativas. Por lo tanto, los ensayos mejorados que miden el nivel de estos contactos podrían ayudar a esclarecer los mecanismos patogénicos de estas enfermedades. En última instancia, el establecimiento de ensayos sencillos y fiables facilitará el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas. Aquí describimos un ensayo de luciferasa dividida para medir cuantitativamente el nivel de contactos ER-mitocondrias en células vivas. Este ensayo se puede utilizar para estudiar el papel fisiopatológico de estos contactos, así como para identificar sus moduladores en el cribado de alto rendimiento.

Introducción

Las interacciones entre el RE y las mitocondrias son vitales para la homeostasis celular y la supervivencia 1,2,3,4. La evidencia previa indica que cualquier tipo de interrupción o desregulación en los sitios de contacto entre el RE y las mitocondrias puede contribuir a varias enfermedades neurodegenerativas, metabólicas y cardiovasculares, así como al cáncer 5,6,7,8,9,10.

Protocolo

1. Mantenimiento de celdas y siembra (Día 1)

1. Mantener HEK293T células en medios de cultivo celular que contengan el medio Eagle Modified de Dulbecco (DMEM) con un 10% de suero fetal bovino (FBS) (en placas de cultivo de 100 mm) en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% de CO₂.
2. Antes de comenzar, verifique la confluencia de la placa observándola bajo el microscopio. Cuando las células alcancen aproximadamente el 80-90% de confluencia, prepárese para sembrar las células en una placa de cultivo de 6 pocillos retirando el medio y lavando con 10 ml de solución salina tamponada con fosfato....

Discusión

Hemos utilizado un ensayo de reensamblaje de Renilla luciferasa 8 dividido (ensayo Rluc dividido) para cuantificar el nivel de acoplamientos RE-mitocondrias. En este estudio, hemos modificado el constructo 24 original de split-Rluc^generando un único vector, pCAG-MitoRluc N-T2A-R luc^CER-IRES-mCherry, que codifica cada componente split-Rluc (MitoRluc^N y Rluc

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL SafeSeal Microcentrifuge Tube	Sorenson	16070
6-well plate TC Treated	USA Scientific	CC7682-7506
10 mL Pipette Tips OneTip	USA Scientific	1110-3700
10 μL pipette tips OneTip	USA Scientific	1110-3700
20-200 μL Beveled tips OneTip	USA Scientific	1111-1210
50 mL Polypropylene Conical Tube	Falcon	352070
96-Well Flipper Microtube Racks	ThermoFisher Scientific	8770-11
96-well plate TC Treated	USA Scientific	CC7682-7596
100 mm x 20 mm TC Treated Dish	USA Scientific	CC7682-3394
1250 μL Tips OneTip	USA Scientific	1112-1720
Centrifuge 5910 Ri - Refrigerated Centrifuge	Eppendorf	5943000131
Dimethyl sulfoxide, anhydrous, ≥99.9%	Sigma-Aldrich	276855-100ML
DMEM, high glucose	ThermoFisher Scientific	11965092
DPBS, no calcium, no magnesium	ThermoFisher Scientific	14190144
EHop 016	Bio-Techne Tocris	6248	Dissolve in DMSO; store at -70 °C
EnduRen Live Cell Substrate	Promega	E6481	Store aliquots at -70 °C
Eppendorf 2-20 μL pipette	Eppendorf	3123000039
Eppendorf Research plus 100-1000 μL pipette	Eppendorf	3123000063
Eppendorf Research Plus 1-10 µL pipette	Eppendorf	3123000020
Eppendorf Research plus 12-channel	Eppendorf	3125000028
Eppendorf Research plus 200 μL pipette	Eppendorf	3123000055
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions	ThermoFisher Scientific	10437028
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator, 184 L, Polished Stainless Steel	ThermoFisher Scientific	381
Hand tally counter	Sigma-Aldrich	HS6594
HEK 293T Cells	ATCC	CRL-3216
Hemacytometer - Neubauer Bright Line, Double-Counting Chamber	LW Scientific	CTL-HEMM-GLDR
Invitrogen TE Buffer	ThermoFisher Scientific	8019005
Microscope	Zeiss	Axiovert 25 CFL
Mini centrifuge	Benchmark Scientific	C1012
Multi Tube Rack For 50ml Conical, 15ml Conical, And Microcentrifuge Tubes	Boekel Scientific	120008
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)	Polysciences	24765-100MG
Pipet-Aid XP	USA Scientific	4440-0101
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P6407-5MG
Rhosin hydrochloride	Bio-Techne Tocris	5003	Dissolve in DMSO; store at -70 °C
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300054
Varioskan LUX multimode microplate reader	ThermoFisher Scientific	VL0000D0
Vortex	ThermoFisher Scientific	2215365	level 8
VWR Vacuum Aspiration System	VWR	75870-734
ZCL 278	Bio-Techne Tocris	4794	Dissolve in DMSO; store at -70 °C