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  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

En este estudio, se desarrollaron y caracterizaron hidrogeles compuestos miméticos nerviosos que se pueden utilizar para investigar y capitalizar el comportamiento pro-regenerativo de las células madre derivadas del tejido adiposo para la reparación de lesiones de la médula espinal.

Resumen

La lesión traumática de la médula espinal (LME) induce un déficit sensoriomotor permanente por debajo del sitio de la lesión. Afecta aproximadamente a un cuarto de millón de personas en los Estados Unidos y representa un problema de salud pública inconmensurable. Se han llevado a cabo investigaciones para proporcionar una terapia eficaz; sin embargo, la lesión de la médula espinal todavía se considera incurable debido a la naturaleza compleja del sitio de la lesión. Se investigan diversas estrategias, como la administración de fármacos, el trasplante de células y los biomateriales inyectables, pero una sola estrategia limita su eficacia para la regeneración. Como tal, recientemente han ganado atención las terapias combinatorias que pueden dirigirse a las características multifacéticas de la lesión. Se ha demostrado que las matrices extracelulares (MEC) pueden aumentar la eficacia del trasplante de células para la LME. Para ello, se desarrollaron y caracterizaron hidrogeles 3D formados por médula espinal descelularizada (dSCs) y nervios ciáticos (dSNs) en diferentes proporciones. El análisis histológico de los dSCs y dSNs confirmó la eliminación de componentes celulares y nucleares, y las arquitecturas de los tejidos nativos se mantuvieron después de la descelularización. Posteriormente, se crearon hidrogeles compuestos en diferentes proporciones volumétricas y se sometieron a análisis de turbidez, cinética de gelificación, propiedades mecánicas y viabilidad de células madre derivadas del tejido adiposo humano (hASC) incrustadas. No se encontraron diferencias significativas en las propiedades mecánicas entre las diferentes proporciones de hidrogeles y matrices de médula espinal descelularizadas. Las ASC humanas incrustadas en los geles permanecieron viables durante los 14 días de cultivo. Este estudio proporciona un medio para generar hidrogeles combinatorios de ingeniería tisular que presentan ECM específica del nervio y células madre mesenquimales pro-regenerativas. Esta plataforma puede proporcionar nuevos conocimientos sobre las estrategias neuro-regenerativas después de la LME con futuras investigaciones.

Introducción

Aproximadamente 296,000 personas sufren de LME traumática, y cada año hay alrededor de 18,000 nuevos casos de LME en los EE. UU.1. La lesión traumática de la médula espinal suele ser causada por caídas, heridas de bala, accidentes automovilísticos y actividades deportivas y, a menudo, provoca la pérdida permanente de la función sensoriomotora por debajo del lugar de la lesión. Los gastos estimados de por vida para el tratamiento de la LME oscilan entre uno y cinco millones de dólares por individuo, con una esperanza de vida significativamente más baja. Sin embargo, la LME sigue siendo poco conocida y en gran medida incurable, principalmente debido a las complejas consecuencias fisiopatológicas después de la lesión2. Se han investigado varias estrategias, entre ellas el trasplante de células y los andamios basados en biomateriales. Si bien el trasplante de células y biomateriales ha demostrado potencial, la naturaleza multifacética de la LME sugiere que los enfoques combinatorios pueden ser más beneficiosos3. Como resultado, se han investigado muchas estrategias combinatorias y se ha demostrado una mejor eficacia terapéutica que los componentes individuales. Sin embargo, se necesitan más estudios para proporcionar nuevos biomateriales para la administración de células y fármacos3.

Un enfoque prometedor para la fabricación de hidrogeles naturales es la descelularización de tejidos. El proceso de descelularización utiliza métodos iónicos, no iónicos, físicos y combinatorios para eliminar todos o la mayoría de los materiales celulares y nucleicos mientras se conservan los componentes de la MEC. Al eliminar todos o la mayoría de los componentes celulares, los hidrogeles derivados de la MEC son menos inmunorreactivos para el huésped después de la implantación/inyección4. Hay varios parámetros que se deben medir para evaluar la calidad de los tejidos descelularizados: eliminación del contenido celular/nucleico, propiedades mecánicas y conservación de la MEC. Se han establecido los siguientes criterios para evitar respuestas inmunitarias adversas: 1) menos de 50 ng de ADN bicatenario (dsDNA) por mg de peso seco de ECM, 2) menos de 200 pb de longitud del fragmento de ADN, y 3) casi o ningún material nuclear visible teñido con 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)5. Las propiedades mecánicas pueden cuantificarse mediante ensayos de tracción, compresión y/o reología, y deben ser similares al tejido original6. Además, la conservación de proteínas puede evaluarse mediante proteómica o ensayos cuantitativos centrados en los componentes principales de los tejidos descelularizados, por ejemplo, laminina, glicosaminoglicano (GAG) y proteoglicano de sulfato de condroitina (CSPG) para la médula espinal 7,8. Los hidrogeles verificados derivados de la MEC pueden recelularizarse con diferentes tipos de células para ayudar a la terapia basada en células9.

Se han estudiado diversos tipos de células, como las células de Schwann, las células de la envoltura olfativa, las células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea (MSC) y las células madre/progenitoras neurales, para la reparación de la LME 10,11,12. Sin embargo, el uso clínico de estas células es limitado debido a preocupaciones éticas, escasa integración con células/tejidos vecinos, falta de fuentes de tejidos de alto rendimiento, incapacidad para autorrenovarse y/o capacidad proliferativa limitada 13,14,15. A diferencia de estos tipos de células, las MSCs derivadas del tejido adiposo humano (hASCs) son candidatas atractivas porque se aíslan fácilmente de forma mínimamente invasiva mediante lipoaspirados, y se puede obtener un gran número de células16. Además, las hASC tienen la capacidad de segregar factores de crecimiento y citocinas que tienen potencial de neuroprotección, angiogenética, cicatrización de heridas, regeneración de tejidos e inmunosupresión 17,18,19,20,21.

Como se ha descrito, se han realizado múltiples estudios 22,23,24 y se ha aprendido mucho de ellos, pero las características heterogéneas de la LME han limitado su eficacia para promover la recuperación funcional. Como tal, se han propuesto enfoques combinatorios para aumentar la eficacia del tratamiento para la LME. En este estudio, se desarrollaron hidrogeles compuestos combinando médula espinal descelularizada y nervios ciáticos para un cultivo tridimensional (3D) de hASC. El éxito de la descelularización se confirmó mediante análisis histológicos y de ADN, y se caracterizaron diferentes proporciones de hidrogeles compuestos nerviosos mediante cinética de gelificación y pruebas de compresión. Se investigó la viabilidad de las hASC en los hidrogeles compuestos nerviosos para demostrar que este hidrogel puede utilizarse como plataforma de cultivo celular en 3D.

Protocolo

Los tejidos porcinos se obtuvieron comercialmente, por lo que no se requirió la aprobación del comité de ética animal.

1. Descelularización de la médula espinal porcina (Tiempo estimado: 5 días)

NOTA: Realizar la descelularización utilizando protocolos previamente establecidos con modificaciones25,26. Todos los procedimientos deben realizarse en una cabina de bioseguridad estéril a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario. Todas las soluciones deben filtrarse estérilmente utilizando un filtro superior de botella (tamaño de poro de 0,2 μm) en botellas esterilizadas en autoclave. Los procedimientos que se llevarán a cabo a 37 °C se pueden realizar dentro de una incubadora o en un horno limpio ajustado a 37 °C.

  1. Preparación de soluciones de descelularización
    NOTA: Todas las soluciones están calculadas para 1 L. Es posible que los usuarios deban ajustar el volumen final requerido de acuerdo con sus necesidades experimentales.
    1. Diluya 500 mL de tripsina/ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) al 0,05% con 500 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) para producir tripsina/EDTA al 0,025%.
    2. Diluya 300 mL de Triton X-100 al 10% con 700 mL de PBS para hacer Triton X-100 al 3%. Mezcle 0,56 g de NaCl, 1,31 g de NaH2PO4H2O y 10,85 g de HNa2O4P·7H2O en 1 L de agua desionizada para hacer 100 mM de Na/50 mM de tampón phos.
    3. Mezclar 32,4 g de sacarosa en 1 L de agua desionizada para hacer 1 M de sacarosa. Mezcle 40 g de desoxicolato de sodio (SD) en 1 L de agua desionizada para hacer una solución de SD al 4%. Diluir 6,7 mL de ácido peracético al 15% con 993,3 mL de etanol al 4%.
  2. Preparación de la médula espinal porcina
    NOTA: La médula espinal se envió congelada sin ninguna solución y se mantuvo a -80 °C hasta su uso.
    1. Descongelar la médula espinal a 4 °C en la nevera durante 18-24 h antes de la descelularización. Use tijeras estériles para quitar la duramadre con cuidado.
    2. Corta la médula espinal en trozos pequeños (de aproximadamente 1 cm de largo). Coloque una pieza en un tubo de 15 mL o un máximo de tres piezas en un tubo de 50 mL.
  3. Descelularización de la médula espinal
    NOTA: Después de cada paso, las soluciones de descelularización se vierten manualmente en un vaso de precipitados grande para desecharlas. Se puede utilizar un pequeño colador de acero inoxidable esterilizable en autoclave para ayudar a desechar las soluciones de descelularización sin perder los tejidos necesarios para cada paso. La médula espinal se agitó a 83 rpm a menos que se indique lo contrario.
    1. Enjuague la médula espinal con agua desionizada durante 18-24 h a 4 °C y 60 rpm.
    2. Enjuague la médula espinal con tripsina al 0,025%/EDTA durante 1 h a 37 °C y 40 rpm. Luego, enjuague la médula espinal con PBS durante 15 minutos, 2 veces.
    3. Enjuague la médula espinal con Triton X-100 al 3% durante 2 h. Enjuague la médula espinal con 100 mM de Na/50 mM de tampón phos durante 15 min, 2 veces.
    4. Enjuague la médula espinal con sacarosa 1 M durante 1 h. A continuación, enjuague la médula espinal con agua desionizada durante 1 h.
    5. Enjuague la médula espinal con 4% SD durante 2 h. A continuación, enjuague la médula espinal con 100 mM de Na/50 mM de tampón phos durante 15 min, 2 veces.
    6. Enjuague la médula espinal con ácido peracético al 0,1% en etanol al 4% durante 4 h. A continuación, enjuague la médula espinal con PBS durante 1 h.
    7. Enjuague la médula espinal con agua desionizada durante 1 h, 2 veces. A continuación, enjuague la médula espinal con PBS durante 1 h.
    8. Liofilizar la médula espinal a 0,01 mbar y -56 °C durante 3 días y almacenar en seco hasta su uso.

2. Descelularización del nervio ciático porcino (Tiempo estimado: 5 días)

NOTA: Realizar la descelularización utilizando un protocolo previamente establecido27. Todos los procedimientos deben realizarse en una cabina de bioseguridad estéril a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario. Todas las soluciones deben filtrarse estérilmente utilizando un filtro superior de botella (tamaño de poro de 0,2 μm) en botellas esterilizadas en autoclave. Los procedimientos que se llevarán a cabo a 37 °C se pueden realizar dentro de una incubadora o en un horno limpio ajustado a 37 °C.

  1. Preparación de soluciones de descelularización
    NOTA: Todas las soluciones están calculadas para 1 L. Es posible que los usuarios deban ajustar el volumen final requerido de acuerdo con sus necesidades experimentales.
    1. Prepare 50 mM de Na/10 mM de tampón phos mezclando 1,86 g de NaCl, 0,262 g de d NaH2PO4H2O y 2,17 g de HNa2O4P·7H2O en 1 L de agua desionizada.
    2. Prepare una solución de sulfobetaína-10 (SB-10) de 125 mM mezclando 38,4 g de SB-10 en 1 L de tampón de 50 mM de Na/10 mM de fósforo.
    3. Prepare una solución de sulfobetaína-16 (SB-16) al 3 % de SD/0,6 mM mezclando 30 g de SD y 0,24 g de SB-16 en 1 L de tampón de 50 mM Na/10 mM de fosfato.
  2. Preparación del nervio ciático porcino
    NOTA: Los nervios ciáticos se enviaron congelados con PBS y se mantuvieron a -80 °C hasta su uso.
    1. Descongelar el nervio ciático a 4 °C en la nevera 18-24 h antes de la descelularización.
    2. Cortar el nervio ciático en trozos pequeños (aproximadamente 1 cm de largo). Coloque una pieza en un tubo de 15 mL o un máximo de tres piezas en un tubo de 50 mL.
  3. Descelularización del nervio ciático
    NOTA: Después de cada paso, las soluciones de descelularización se vierten manualmente en un vaso de precipitados grande para desecharlas, y se puede usar un pequeño colador de acero inoxidable esterilizable en autoclave para ayudar a desechar las soluciones de descelularización sin perder los tejidos necesarios para cada paso. El nervio ciático se agitó a 15 rpm a menos que se indique lo contrario.
    1. Enjuague el nervio ciático con agua desionizada durante 7 h. A continuación, enjuague el nervio ciático con 125 mM de sulfobetaína-10 (SB-10) en tampón phos de 50 mM Na/10 mM durante 18 h.
    2. Enjuague el nervio ciático con 100 mM de Na/50 mM de tampón phos durante 15 min. A continuación, enjuague el nervio ciático con 3% SD/0,6 mM de sulfobetaína-16 (SB-16) en tampón phos de 50 mM Na/10 mM durante 2 h.
    3. Enjuague el nervio ciático con 100 mM de Na/50 mM de tampón de fosfato durante 15 min, 3 veces. A continuación, enjuague el nervio ciático con 125 mM SB-10 en tampón de 50 mM Na/10 mM phos durante 7 h.
    4. Enjuague el nervio ciático con 100 mM de Na/50 mM de tampón phos durante 15 min. A continuación, enjuague el nervio ciático con SD al 3%/0,6 mM SB-16 en tampón 50 mM Na/10 mM phos durante 1,5 h.
    5. Enjuague el nervio ciático con 50 mM de Na/10 mM de tampón phos durante 15 min, 3 veces. A continuación, enjuague el nervio ciático con 75 U/mL de desoxirribonucleasa (DNasa) durante 3 h sin agitar.
    6. Enjuague el nervio ciático con 50 mM de Na/10 mM de tampón de fosfato durante 1 h, 3 veces. A continuación, enjuagar el nervio ciático con 0,2 U/mL de condroitinasa ABC durante 16 h sin agitar a 37 °C.
    7. Enjuague el nervio ciático con PBS durante 3 h, 3 veces. Liofilizar el nervio ciático a 0,01 mbar y -56 °C durante 3 días y almacenar en seco hasta su uso.

3. Digestión de tejidos descelularizados y fabricación de hidrogeles compuestos (Tiempo estimado: 4 días)

  1. Picar o moler los tejidos descelularizados hasta convertirlos en polvo con unas tijeras o un homogeneizador. Esterilizar las herramientas para picar o triturar los tejidos utilizando un autoclave a 121 °C durante 45 min. El método del óxido de etileno también es aplicable.
  2. Digiera los tejidos por separado en una solución de ácido clorhídrico (HCl) 0,01 N que contenga 1 mg/ml de pepsina a una concentración de 15 mg/mL. Los pesos estimados de la médula espinal descelularizada y el nervio ciático son 50-100 mg y 100-150 mg por pieza, respectivamente.
  3. Coloque la barra magnética y agite a 500 rpm y 4 °C durante al menos 4 días para generar soluciones de pregel.
  4. Mezcle el pregel del nervio ciático y la médula espinal en las siguientes proporciones volumétricas: 2:1, 1:1 y 1:2. Ajuste el pH 7,4 con hidróxido de sodio (NaOH) 1 N y HCl y diluya hasta la concentración deseada con medios M199 y 1x PBS. Incubar a 37 °C durante 30 min.
    NOTA: Agregue NaOH 1 μL a la vez. Los medios M199 se pueden usar como indicadores de pH, ya que se vuelven de color rosa claro cuando el pH es de 7.4, pero se deben usar tiras de pH para confirmar el nivel de pH.

4. Verificación de la descelularización

  1. Tinción con hematoxilina y eosina (H&E; Tiempo estimado: 8 días)
    NOTA: Después de cada paso de enjuague, las soluciones se vierten manualmente en un vaso de precipitados grande para desecharlas.
    1. Fijar la médula espinal y el nervio ciático frescos y descelularizados en formaldehído al 3,7% a 4 °C durante 18 h. Coloque una pieza en un tubo de 15 ml.
    2. Retire el formaldehído y coloque los pañuelos en sacarosa al 10% durante 1 día. Retirar el 10% de sacarosa y colocar los tejidos en sacarosa al 30% durante 6 días.
    3. Llene un molde criomónico de tamaño adecuado con una temperatura de corte óptima (OCT) hasta la mitad. Coloque los tejidos descelularizados, cúbralos con OCT y deje que absorban la OCT durante 1 día.
    4. Después de 1 día, congele los tejidos durante la noche a -80 °C. Crioseccionar los tejidos a 10 μm de espesor utilizando un criostato.
    5. Enjuague con 1x PBS durante 5 min, 2x. Luego, enjuague con agua del grifo durante 5 minutos.
    6. Teñir con solución de hematoxilina durante 1 min. Enjuague con agua del grifo durante 1 min, 3 veces.
    7. Teñir con solución de eosina durante 1 min. Enjuague con etanol al 95 % durante 1 min, 2 veces y con etanol al 100 % durante 1 min, 3 veces.
    8. Enjuague con xileno durante 1 min, 2 min, y luego 1 min. Deja que los portaobjetos se sequen durante 5 min.
    9. Use un hisopo de algodón para gotear de 3 a 4 gotas de solución de montaje de dibutilftalato de poliestireno xileno (DPX) en los portaobjetos. Coloque los cubreobjetos encima de los portaobjetos cubiertos por DPX. Deja que los portaobjetos se sequen durante la noche.
  2. Análisis de ADN (Tiempo estimado: 1 h)
    1. Pesar tejidos descelularizados y liofilizados. Aísle y cuantifique el ADN utilizando kits disponibles en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

5. Caracterización de hidrogeles compuestos

  1. Prueba de turbidez de gelificación (Tiempo estimado: 1 h)
    1. Coloque 100 μL de soluciones de pregel en cada pocillo de una placa de 96 pocillos sobre hielo. Lea la absorbancia a 405 nm cada 2 minutos durante 45 minutos utilizando un lector de placas.
    2. Calcule la absorbancia normalizada utilizando la siguiente ecuación:
      (Absorbancia - Absorbanciainicial) / (Absorbanciamáxima - Absorbanciainicial)
    3. Calcular la pendiente de la curva y el tiempo para lograr una gelificación del 50% y 95%, t1/2 y t95, respectivamente.
  2. Prueba de compresión (Tiempo estimado: 1 min por hidrogel)
    1. Fabricar hidrogeles compuestos a una concentración de 12 mg/mL con 8 mm de diámetro y 2 mm de altura.
    2. Utilice un reómetro para comprimir las muestras con una carga de 250 N entre placas paralelas de acero inoxidable a una velocidad de deformación del 10% de la altura de la muestra/min. El software que proporciona las lecturas del reómetro proporcionará una curva de tensión-deformación aplicando la fuerza y midiendo la deformación hasta que los hidrogeles se rompan.
    3. Calcule el módulo de Young a partir de la pendiente de la región lineal de las curvas tensión-deformación.

6. Cultivo tridimensional de ASCs humanas en hidrogeles compuestos nerviosos

  1. Preparación de plataforma tridimensional (3D) (Tiempo estimado: 3 h)
    1. Grabe oblea de silicio con fotorresistencia SU-8 para generar patrones circulares de 200 μm de profundidad y 4 mm de diámetro.
    2. Mezcle la base de polidimetilsiloxano (PDMS) y el agente de curado en una proporción de 10:1. Vierta la mezcla sobre la oblea de silicona y déjela reposar durante 20 minutos para eliminar todas las burbujas que surgen al mezclar la base de PDMS y el agente de curado.
    3. Introducirlo en el horno y curar durante 2 h a 70 °C. Desmoldar la lámina de PDMS curada y perforarla con un punzón de biopsia de 8 mm de diámetro para hacer micropocillos de PDMS.
    4. Coloque los micropocillos en una placa de 96 pocillos y coloque la placa de pocillos en un limpiador de aire-plasma para esterilizar los micropocillos de PDMS.
    5. Funcionalizar micropocillos de PDMS con 1% de polietileneimina (PEI) y 0,1% de glutaraldehído (GA) durante 10 min y 20 min, respectivamente. Lave los micropocillos con agua destilada, 2 veces.
  2. Preparación de hASCs (Tiempo estimado: 7 días)
    1. Cultive células de paso de 2 a 5 conductos en medios de crecimiento de hASCs (medios basales de hASCs suplementados con suero fetal bovino (FBS) y penicilina/estreptomicina (Pen-strep)) hasta que confluenten. Pase y calcule el número de células mediante el uso de un hemacitómetro o contador de células.
  3. Hidrogeles compuestos nerviosos cargados de ASC (Tiempo estimado: 2 h)
    1. Mezcle el pregel para el nervio ciático y la médula espinal en una proporción volumétrica de 2:1, 1:1, 1:2 y prepare hidrogel solo para la médula espinal sin mezclar ningún pregel para el nervio ciático.
    2. Agregue el medio M199 y ajuste el pH 7.4 usando 1 N NaOH y HCl. Vuelva a suspender los hASC con el medio de crecimiento en el pregel a una densidad de 1 x 106 células/mL.
      NOTA: La cantidad de M199 y suspensión celular debe ser del 10% de pregel.
    3. Diluya el pregel a 12 mg/mL usando 1x PBS. Coloque el pregel en micropocillos e incube durante 30 minutos. Cultivo de hidrogeles cargados de ASC en medios de crecimiento de hASCs.
  4. Test de viabilidad celular (Tiempo estimado: 4 h al día)
    1. Prepare las soluciones de las pruebas de viabilidad utilizando los reactivos disponibles en el mercado de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
    2. Aspire los medios en los días 1, 4, 7 y 14. Añadir reactivo a los pocillos e incubar a 37 °C durante 3 h siguiendo las instrucciones del fabricante.
    3. Lea la fluorescencia a una excitación/emisión de 560/590 nm utilizando un lector de placas. Calcula la diferencia porcentual usando la siguiente ecuación:
      [(muestra de fluorescencia-fluorescencia en blanco) /fluorescencia en blanco] x 100

Resultados

Los tejidos descelularizados se prepararon utilizando protocolos previamente establecidos con ligeras modificaciones26,27. Después de la descelularización, liofilización y digestión, se fabricaron hidrogeles compuestos nerviosos en proporciones de SN:SC = 2:1, 1:1, 1:2 e hidrogeles solo de la médula espinal (Figura 1). La remoción de componentes nucleares se confirmó mediante tinción de H&E (...

Discusión

Se cree ampliamente que la fisiopatología de la LME es compleja y multifacética. A pesar de que las terapias individuales, como el trasplante de células, la administración de fármacos y los biomateriales, han proporcionado información valiosa sobre la LME, la naturaleza complicada de la LME puede limitar su eficacia individual 28,29,30,31. Por lo tanto, l...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación PhRMA y los Institutos Nacionales de Salud a través del premio número P20GM139768 y R15NS121884 otorgado a YS. Queremos agradecer al Dr. Kartik Balachandran y al Dr. Raj Rao del Departamento de Ingeniería Biomédica de la Universidad de Arkansas por permitirnos utilizar sus equipos. Además, queremos agradecer al Dr. Jin-Woo Kim y al Sr. Patrick Kuczwara del Departamento de Ingeniería Biológica y Agrícola de la Universidad de Arkansas por brindar capacitación sobre reómetro.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
3-(Decyldimethylammonio)propane sulfonate inner saltSigma-AldrichD4266Used during sciatic nerve decellularization, SB-10
3-(N,N-Dimethylpalmitylammonio)propane sulfonateSigma-AldrichH6883Used during sciatic nerve decellularization, SB-16
AlamarBlue reagentFisher ScientificDAL1100Used during AlamaBlue cell viabiiltiy test
Chondroitinase ABCSigma-AldrichC3667Used during sciatic nerve decellularization
CryostatLeicaCM1860
DeoxyribonuclaseSigma-AldrichD4263Used during sciatic nerve decellularization
Disodium hydrogen phosphate heptahydrateVWRBDH9296Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
DNeasy Blood & Tissue kitQiagen69506Used during DNA analysis
Dpx Mountant for histology,slide mounting mediumSigma-Aldrich6522Used during H&E staining
EosinSigma-AldrichHT110216Used during H&E staining
EthanolVWR89125-172
FormaldehydeSigma-Aldrich252549Used during H&E staining
Glutaraldehyde (GA)Sigma-AldrichG6257Used during PDMS surface functionalization
hASC growth mediaLonzaPT-4505Used to culture hASCs, containing of fetal bovine serum and penicilin/streptomycin
HematoxylinVWR26041-06Used during H&E staining
human adipose-derived stem cellLonzaPT-5006
Hydrochloric acid (HCl)Sigma-Aldrich320331Used to digest decellularizied tissues and adjust pregels solutions
M199 mediaSigma-AldrichM0650Used to dilute pregels to desired concentration
Optimal cutting temperatue compoundTissue-Tek4583
PepsinSigma-AldrichP7000Used to digest decellularized tissues
Peracetic acidLab AlleyPAA1001Used during spinal cord decellularization
Phosphate buffered saline (PBS)VWR97062-948
Plate readerBioTek InstrumentsSynergy Mx
Polyethyleneimine (PEI)Sigma-Aldrich181978Used during PDMS surface functionalization
Porcine sciatic nerveTissue Source LLCLive pigs, with no identifiable information and no traceability details
Porcine spinal cordTissue Source LLCLive pigs, with no identifiable information and no traceability details
QuantiFluor dsDNA systemPromegaE2670Used to analyze DNA contents
RheometerTA InstrumentsDHR 2
Rugged rotatorGlas-co099A RD4512Used during spinal cord decellularization
Sodium chloride (NaCl)VWRBDH9286Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750
Sodium dihydrogen phosphate monohydrateVWRBDH9298Chemical for 100 mM Na/50 mM phos and 50 mM Na/10 mM phos buffer
Sodium hydroxide solution (NaOH)Sigma-Aldrich415443Used to adjust pregels solutions
SU-8Kayaku advnaced materialsSU8-100Used to coat silicon wafer
SucroseSigma-AldrichS8501Used during spinal cord decellularization
Sylgard 184 silicone elastomer kitDOW1317318Polydimethylxiloxane (PDMS) base and curing agent
Triton X-100Sigma-AldrichX100Used during spinal cord decellularization
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redThermo Fisher25300062Used during hASC work and during spinal cord decellularization
Tube revolver rotatorThermo Fisher88881001Used during sciatic nerve decellularization
XyleneVWRMK866816Used during H&E staining

Referencias

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  5. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
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